Aplicação e uso do princípio do microscópio de fluorescência
(1) O princípio e as características estruturais do microscópio de fluorescência: o microscópio de fluorescência usa uma fonte de luz pontual com alta eficiência luminosa para emitir luz de um determinado comprimento de onda (como luz ultravioleta de 3.650 pol. ou luz azul roxa de 4.200 pol.) através do sistema de filtro como a luz de excitação para excitar a amostra. Depois que a substância fluorescente em seu interior emite fluorescência de várias cores, ela é observada através da ampliação da lente objetiva e da ocular. Desta forma, sob um fundo de forte contraste, mesmo que a fluorescência seja muito fraca, é fácil de identificar e tem alta sensibilidade. É usado principalmente para a pesquisa da estrutura e função celular e da composição química. A estrutura básica de um microscópio de fluorescência é composta por um microscópio óptico comum mais alguns acessórios (como uma fonte de luz fluorescente, um filtro de excitação, um divisor de feixe de duas cores e um filtro de bloqueio, etc.). Fonte de luz fluorescente - geralmente usa lâmpada de mercúrio de ultra-alta pressão (50-200W), que pode emitir luz de vários comprimentos de onda, mas cada substância fluorescente tem um comprimento de onda de excitação que produz a fluorescência mais forte, portanto, um filtro de excitação (Geralmente, existem filtros de excitação ultravioleta, roxo, azul e verde), que permitem apenas que a luz de excitação de um determinado comprimento de onda passe e irradie a amostra, enquanto absorve outra luz. Depois que cada substância é irradiada pela luz de excitação, ela emite fluorescência visível com comprimento de onda maior que o comprimento de onda de irradiação em um tempo muito curto. A fluorescência é específica e geralmente mais fraca que a luz de excitação. Para observar fluorescência específica, é necessário um filtro de bloqueio (ou supressão) atrás da lente objetiva. Tem duas funções: uma é absorver e bloquear a entrada da luz de excitação na ocular, para não perturbar a fluorescência e danificar os olhos; a outra é selecionar e deixar passar a fluorescência específica, mostrando uma cor fluorescente específica. Os dois filtros devem ser usados juntos.
Existem dois tipos de microscópios de fluorescência em termos de caminhos ópticos:
1. Microscópio de fluorescência de transmissão: A fonte de luz de excitação é passada através do material da amostra através de uma lente condensadora para excitar a fluorescência. Um coletor de campo escuro é comumente usado, e um coletor comum também pode ser usado para ajustar o espelho de modo que a luz de excitação seja redirecionada e desviada para a amostra. Este é um microscópio fluorescente mais antigo. A vantagem é que a fluorescência é forte em baixa ampliação, mas a desvantagem é que a fluorescência diminui com o aumento da ampliação. Portanto, é melhor observar materiais de amostra maiores.
2. O microscópio de epifluorescência é um novo tipo de microscópio de fluorescência desenvolvido nos tempos modernos. A diferença é que a luz de excitação cai da lente objetiva para a superfície da amostra, ou seja, a mesma lente objetiva é utilizada como condensador de iluminação e lente objetiva para coleta de fluorescência. Um divisor de feixe dicróico precisa ser adicionado no caminho da luz, que está a 45 graus de distância do urânio leve. A luz de excitação é refletida na lente objetiva e coletada na amostra. A fluorescência gerada pela amostra e a luz de excitação refletida pela superfície da lente da lente objetiva e pela superfície da tampa de vidro entram na lente objetiva ao mesmo tempo e retornam ao divisor de feixe de duas cores para tornar a luz de excitação separada da fluorescência , a luz de excitação residual é absorvida pelos filtros de bloqueio. Tal como mudar para uma combinação de diferentes filtros de excitação/divisor de feixe de duas cores/filtro de bloqueio, ele pode atender às necessidades de diferentes produtos de reação fluorescente. A vantagem deste tipo de microscópio de fluorescência é que a iluminação do campo de visão é uniforme, a imagem é nítida e quanto maior a ampliação, mais forte será a fluorescência.
(2) Como usar o microscópio de fluorescência.
1. Ligue a fonte de luz e a lâmpada de mercúrio de ultra-alta pressão precisa aquecer por alguns minutos para atingir o ponto mais brilhante.
2. O microscópio de fluorescência de transmissão precisa instalar o filtro de excitação necessário entre a fonte de luz e o condensador e instalar o filtro de bloqueio correspondente atrás da lente objetiva. Os microscópios de epifluorescência precisam inserir o filtro de excitação/divisor de feixe de duas cores/inserções de filtro de bloqueio necessárias nas ranhuras do caminho da luz.
3. Observe com lente de baixa ampliação e ajuste o centro da fonte de luz de forma que fique localizada no centro de todo o ponto de iluminação de acordo com o dispositivo de ajuste de diferentes modelos de microscópios de fluorescência.
4. Coloque a amostra e observe após focar. Atenção deve ser dada durante o uso: não observar diretamente com o filtro final, para não causar danos aos olhos; ao observar amostras com lentes de óleo, deve-se usar lentes de óleo especiais sem fluorescência; depois que a lâmpada de mercúrio de alta pressão é desligada, ela não pode ser ligada novamente imediatamente, ela precisa ser testada. Pode ser reiniciado após 5 minutos, caso contrário ficará instável e afetará a vida útil da lâmpada de mercúrio.
(3) Observe as células coradas com 00,01 por cento de corante fluorescente laranja acridina sob o microscópio fluorescente na plataforma de ensino com um filtro de luz azul-violeta. O núcleo e o citoplasma são excitados para produzir duas cores diferentes de fluorescência (verde escuro e vermelho alaranjado).
