Por que precisamos de microscopia confocal?
1. Após os esforços e melhorias de nossos grandes antecessores, o microscópio óptico atingiu um nível perfeito. Na verdade, os microscópios comuns podem nos fornecer belas imagens microscópicas de forma simples e rápida. Porém, ocorreu um evento que trouxe inovação revolucionária a este mundo quase perfeito dos microscópios, que foi a invenção do “microscópio confocal de varredura a laser”. A característica desse novo tipo de microscópio é que ele adota um sistema óptico que extrai apenas as informações da imagem na superfície onde o foco está concentrado. Ao alterar o foco e restaurar as informações obtidas na memória da imagem, pode-se obter imagens vívidas com completa inteligência de informação 3D. Através deste método, podem ser facilmente obtidas informações sobre o formato da superfície que não podem ser confirmadas por microscópios convencionais. Além disso, para microscópios ópticos típicos, "aumentar a resolução" e "aprofundar a profundidade focal" são condições contraditórias, especialmente em grandes ampliações. Contudo, em microscópios confocal, este problema é facilmente resolvido.
2. Vantagens dos sistemas ópticos confocal
O sistema óptico confocal é utilizado para iluminação pontual da amostra, e a luz refletida também é recebida por um sensor pontual. Quando a amostra é colocada na posição focal, quase toda a luz refletida pode atingir o sensor. Quando a amostra se desvia do ponto focal, a luz refletida não consegue atingir o sensor. Ou seja, em um sistema óptico confocal, apenas a imagem que coincide com o foco será emitida, e o ponto e a luz dispersa inútil serão protegidos.
Por que usar laser?
Em sistemas ópticos confocal, a iluminação pontual é aplicada à amostra, e a luz refletida também é recebida por um sensor pontual. Portanto, fontes de luz pontuais tornaram-se necessárias. O laser é uma fonte de luz muito pontual. Na maioria dos casos, a fonte de luz da microscopia confocal é o laser. Além disso, a monocromaticidade, a direcionalidade e o excelente formato do feixe dos lasers também são razões importantes para sua ampla adoção.
4. A observação em tempo real baseada em varredura de alta velocidade torna-se possível
A varredura a laser utiliza Refletor Óptico Acústico (AO) na direção horizontal e espelho Servo Galvano na direção vertical. Devido à ausência de vibrações mecânicas na unidade de polarização óptica de áudio, é possível realizar varredura em alta velocidade e observar em tempo real na tela de monitoramento. A alta velocidade deste tipo de câmera é um fator muito importante que afeta diretamente a velocidade de foco e recuperação de posição.
5. A relação entre posição focal e brilho
Em um sistema óptico confocal, quando a amostra é colocada corretamente na posição focal, o brilho é alto e o brilho diminui drasticamente antes e depois (linha sólida na Figura 4). A seletividade sensível deste plano focal é precisamente o princípio por trás da determinação da direção da altura e da expansão da profundidade focal na microscopia confocal. Comparado a isto, os microscópios ópticos típicos não mostram alterações significativas de brilho antes e depois da posição focal (linha pontilhada na Figura 4).
6. Alto contraste e resolução
Um microscópio óptico típico, devido à interferência causada pelo desvio da luz refletida do ponto focal, sobrepõe-se à parte focal da imagem, resultando em uma diminuição no contraste da imagem. Em contrapartida, nos sistemas ópticos confocal, a luz espalhada fora do foco e a luz espalhada dentro da lente objetiva são quase completamente removidas, obtendo-se assim imagens com altíssimo contraste. Além disso, devido ao fato de a luz passar duas vezes pela lente objetiva, a imagem pontual torna-se primeiro mais nítida, o que também melhora a resolução do microscópio.
