O que é Microscopia de Fluorescência de Dois Fótons
O princípio básico da excitação de dois fótons é: no caso de alta densidade de fótons, as moléculas fluorescentes podem absorver dois fótons de comprimento de onda longo ao mesmo tempo e emitir um fóton de comprimento de onda mais curto após um curto período do chamado tempo de vida do estado excitado . ; o efeito é o mesmo que usar um fóton cujo comprimento de onda é metade do comprimento de onda longo para excitar uma molécula fluorescente. A excitação de dois fótons requer uma alta densidade de fótons. Para não danificar as células, a microscopia de dois fótons usa lasers pulsados de modo bloqueado de alta energia. O laser emitido por este laser possui alta energia de pico e baixa energia média, sua largura de pulso é de apenas 100 femtossegundos e sua frequência pode chegar a 80 a 100 megahertz. Ao usar uma lente objetiva de alta abertura numérica para focar os fótons do laser pulsado, a densidade de fótons no ponto focal da lente objetiva é a mais alta e a excitação de dois fótons ocorre apenas no ponto focal da lente objetiva, então o microscópio de dois fótons não precisa de um orifício confocal, o que melhora a eficiência da detecção de fluorescência.
Em fenômenos gerais de fluorescência, devido à baixa densidade de fótons da luz de excitação, uma molécula fluorescente pode absorver apenas um fóton ao mesmo tempo e, em seguida, emitir um fóton fluorescente por meio de uma transição radiativa, que é a fluorescência de fóton único. Para o processo de excitação de fluorescência usando laser como fonte de luz, pode ocorrer fluorescência de dois fótons ou mesmo de vários fótons. Neste momento, a intensidade da fonte de luz de excitação usada é alta e a densidade de fótons atende aos requisitos de moléculas fluorescentes que absorvem dois fótons ao mesmo tempo. No processo de uso de um laser geral como fonte de luz de excitação, a densidade de fótons ainda não é suficiente para produzir o fenômeno de absorção de dois fótons. Normalmente, utiliza-se um laser pulsado de femtossegundos, cuja potência instantânea pode atingir a ordem de megawatts. Portanto, o comprimento de onda da fluorescência de dois fótons é menor do que o comprimento de onda da luz de excitação, que é equivalente ao efeito produzido pela excitação na metade do comprimento de onda de excitação.
