Qual é a finalidade de um microscópio confocal?
1. Após os esforços e melhorias de nossos grandes predecessores, o microscópio óptico atingiu o ponto de perfeição. Na verdade, os microscópios comuns podem nos fornecer belas imagens microscópicas de forma simples e rápida. No entanto, aconteceu um evento que trouxe uma inovação revolucionária para este mundo de microscópio quase perfeito, que é a invenção do "microscópio confocal de varredura a laser". A característica deste novo tipo de microscópio é que ele adota um sistema ótico que apenas extrai as informações da imagem na superfície onde o foco está concentrado, e restaura as informações obtidas na memória da imagem ao mudar o foco, para que informações 3D completas possam ser obtido. Uma imagem gritante de inteligência. Com este método, é possível obter facilmente informações sobre a forma da superfície que não podem ser confirmadas com um microscópio normal. Além disso, para microscópios ópticos comuns, "resolução crescente" e "profundidade de foco aprofundada" são condições contraditórias, especialmente em altas ampliações, essa contradição é mais proeminente, mas em termos de microscópios confocais, esse problema é facilmente resolvido.
2. Vantagens do sistema óptico confocal
Diagrama esquemático do microscópio confocal a laser
O sistema óptico confocal realiza a iluminação pontual na amostra, e a luz refletida também é recebida pelo receptor pontual. Quando a amostra é colocada na posição de foco, quase toda a luz refletida pode atingir o fotorreceptor e, quando a amostra está fora de foco, a luz refletida não consegue atingir o fotorreceptor. Ou seja, no sistema óptico confocal, apenas a imagem que coincidir com o ponto focal será emitida, e os pontos de luz e a luz espalhada inútil serão blindados.
3. Por que usar laser?
No sistema óptico confocal, a amostra é iluminada em um ponto e a luz refletida também é recebida por um fotorreceptor pontual. Portanto, uma fonte de luz pontual torna-se necessária. Os lasers são fontes de luz muito pontuais. Na maioria dos casos, fontes de luz laser são usadas como fontes de luz para microscópios confocais. Além disso, as características de monocromaticidade, direcionalidade e excelente formato do feixe de laser também são razões importantes para sua ampla adoção.
4. A observação em tempo real com base na varredura de alta velocidade torna-se possível
Para varredura a laser, a unidade de deflexão óptica ativada acústica (Acoustic Optical Deflector, elemento AO) é usada na direção horizontal, e o Servo Galvano-mirror é usado na direção vertical. Como a unidade de deflexão acústico-óptica não possui parte de vibração mecânica, ela pode realizar varredura de alta velocidade e observação em tempo real na tela do monitor é possível. Esta imagem de alta velocidade é um item muito importante que afeta diretamente a velocidade de foco e recuperação de posição.
5. A relação entre posição de foco e brilho
No sistema óptico confocal, o brilho da amostra é máximo quando a amostra é colocada corretamente na posição focal, e seu brilho diminuirá acentuadamente antes e depois dela (a linha sólida na Figura 4). A seletividade sensível do plano focal também é o princípio da determinação da direção da altura do microscópio confocal e da expansão da profundidade focal. Em contraste, os microscópios ópticos comuns não apresentam mudanças significativas de brilho antes e depois da posição do foco.
6. Alto contraste, alta resolução
Em microscópios ópticos comuns, devido à interferência da luz refletida na parte do foco, ela se sobrepõe à parte da imagem do foco, resultando em uma diminuição do contraste da imagem. Por outro lado, no sistema óptico confocal, a luz espalhada fora do ponto focal e a luz espalhada dentro da lente objetiva são quase completamente removidas, de modo que uma imagem com contraste muito alto pode ser obtida. Além disso, como a luz passa pela lente objetiva duas vezes, a imagem pontual é aguçada primeiro, o que também melhora o poder de resolução do microscópio.
7. Função de localização óptica
No sistema óptico confocal, a luz refletida que não seja o ponto coincidente com o ponto focal é protegida pelo microporo. Portanto, ao observar uma amostra tridimensional, forma-se uma imagem como se a amostra fosse cortada com o plano focal (Figura 5). Este efeito é conhecido como localização óptica e é uma das especialidades dos sistemas ópticos confocais.
8. Concentre-se na função de memória móvel
A chamada luz refletida fora do ponto focal é protegida pelos microporos. Por outro lado, pode-se considerar que todos os pontos da imagem formada pelo sistema óptico confocal coincidem com o ponto focal. Portanto, se a amostra tridimensional for movida ao longo do eixo Z (eixo óptico), as imagens são acumuladas e armazenadas na memória e, finalmente, será obtida a imagem formada por toda a amostra e o ponto focal. A função de aprofundar infinitamente a profundidade do foco dessa maneira é chamada de função de memória móvel.
9. Função de medição da forma da superfície
Em termos de função de deslocamento de foco, a forma da superfície da amostra pode ser medida sem contato adicionando um circuito de registro da altura da superfície. Com base nessa função, é possível registrar as coordenadas do eixo Z formadas pelo valor máximo de luminância em cada pixel e, com base nessas informações, obter informações relacionadas ao formato da superfície da amostra.
10. Função de medição de tamanho micro de alta precisão
A unidade receptora de luz adota um sensor de imagem CCD 1-dimensional, de modo que não é afetado pela inclinação de digitalização do dispositivo de digitalização, para que a medição de alta precisão possa ser concluída. Além disso, devido ao uso da função de memória de deslocamento de foco com profundidade de foco ajustável (aprofundamento), o erro de medição causado pelo deslocamento de foco pode ser eliminado.
11. Análise de imagem tridimensional
Usando a função de medição da forma da superfície, você pode facilmente criar uma imagem tridimensional da superfície da amostra. Não apenas isso, mas também pode realizar uma variedade de análises, como: medição de rugosidade de superfície, área, volume, área de superfície, circularidade, raio, comprimento máximo, perímetro, centro de gravidade, imagem tomográfica, transformação FFT, medição de largura de linha, etc. .
O microscópio de varredura confocal a laser pode ser usado não apenas para observar a morfologia celular, mas também para análise quantitativa de componentes bioquímicos intracelulares, estatísticas de densidade óptica e medição da morfologia celular.
