A diferença entre microscópio de fluorescência (dois fótons, confocal) e microscópio comum
O princípio básico da excitação de dois fótons é que, em alta densidade de fótons, as moléculas fluorescentes podem absorver simultaneamente dois fótons de comprimento de onda longos e emitir um fóton de comprimento de onda mais curto após um curto período da chamada vida útil do estado excitado; O efeito é o mesmo que usar um fóton com metade do comprimento de onda do comprimento de onda longo para excitar moléculas fluorescentes. Duas excitação de fótons requer uma alta densidade de fótons e, para evitar que as células prejudiciais, a microscopia de dois fótons use lasers de pulso bloqueados no modo de alta energia. O laser emitido por esse laser possui alta energia de pico e baixa energia média, com uma largura de pulso de apenas 100 femtossegundos e uma frequência de até 80 a 100 megahertz. Ao usar uma lente objetiva de abertura numérica alta para focar os fótons de um laser pulsado, a densidade de fótons no ponto focal da lente objetivo é a mais alta e a excitação de dois fótons ocorre apenas no ponto focal da lente objetiva. Portanto, o microscópio de dois fótons não requer um orifício confocal, o que melhora a eficiência da detecção de fluorescência.
Em fenômenos gerais de fluorescência, devido à baixa densidade de fótons da luz de excitação, uma molécula fluorescente pode absorver apenas um fóton por vez e depois emitir outro fóton fluorescente através da transição radiativa, que é conhecida como fluorescência de fóton único. Para processos de excitação de fluorescência, utilizando lasers como fontes de luz, podem ocorrer fenômenos de fluorescência de dois fóton ou até multifóton. Nesse caso, a fonte de luz de excitação utilizada possui alta intensidade e densidade de fótons que atende à exigência de moléculas fluorescentes para absorver dois fótons simultaneamente. No processo de usar um laser geral como fonte de luz de excitação, a densidade de fótons ainda é insuficiente para produzir fenômeno de absorção de dois fótons. Normalmente, são usados lasers de pulso de femtossegundos, com energia instantânea atingindo o nível megawatt. Portanto, o comprimento de onda da fluorescência de dois fótons é mais curto que o da luz de excitação, equivalente ao efeito produzido pela excitação pela metade do comprimento de onda de excitação.
Conhecimento relacionado à microscopia de fluorescência confocal
O princípio básico da microscopia confocal de fluorescência é usar uma fonte de luz pontual para irradiar a amostra, formando um pequeno ponto de luz bem definido no plano focal. A fluorescência emitida deste ponto após a irradiação é coletada pela lente objetiva e enviada de volta ao longo do caminho de irradiação original para o divisor de feixe composto por um espelho dicróico. O espectrômetro envia fluorescência diretamente para o detector. Há um orifício na frente da fonte de luz e do detector, chamado poço de iluminação e orifício de detecção, respectivamente. As dimensões geométricas dos dois são consistentes, aproximadamente 100-200 nm; Comparado ao ponto de luz no plano focal, os dois são conjugados, o que significa que o ponto de luz passa por uma série de lentes e pode finalmente se concentrar no orifício da iluminação e no poço de detecção simultaneamente. Dessa maneira, a luz do plano focal pode convergir dentro da faixa do orifício de detecção, enquanto a luz dispersa de cima ou abaixo do plano focal é bloqueada fora do orifício de detecção e não pode ser fotografada. Digitando o ponto de amostra a ponto com um laser, o tubo fotomultiplicador após a detecção do orifício também obtém a imagem confocal correspondente do ponto de ponto leve a ponto, converte -o em um sinal digital e o transmite para o computador e finalmente o agrega em uma imagem confocal clara de todo o plano focal na tela.
