Princípios da Microscopia Confocal a Laser (LSCM)
Um microscópio confocal a laser usa um orifício de iluminação colocado atrás da fonte de luz e um orifício de detecção colocado na frente do detector para obter iluminação pontual e detecção pontual. A luz da fonte de luz é focada em um ponto no plano focal da amostra pela luz emitida através do orifício de iluminação, e a fluorescência emitida desse ponto é visualizada dentro do orifício de detecção, e qualquer luz emitida fora desse ponto é bloqueada pelo furo de detecção. O pinhole de iluminação e o pinhole de detecção são conjugados para o ponto iluminado ou detectado, de modo que o ponto detectado é o ponto confocal e o plano onde o ponto detectado está localizado é o plano confocal. O computador exibe o ponto detectado na tela do computador na forma de um ponto de imagem. Para produzir uma imagem completa, um sistema de varredura no caminho óptico varre o plano focal da amostra, produzindo assim uma imagem confocal completa. Enquanto o estágio transportador for movido para cima e para baixo ao longo do eixo Z, um novo nível da amostra é movido para o plano confocal, e o novo nível da amostra é visualizado no monitor, à medida que o eixo Z continua a movimento, são obtidas imagens sucessivas de corte de luz de diferentes níveis da amostra.
O microscópio óptico tradicional utiliza uma fonte de luz de campo, a imagem de cada ponto da amostra sofrerá interferência da difração ou dispersão da luz dos pontos vizinhos; O microscópio confocal de varredura a laser usa um feixe de laser através do orifício iluminado para formar uma fonte de luz pontual na amostra digitalizada em cada ponto do plano focal interno, a amostra no ponto irradiado, a imagem do orifício de detecção, pela detecção do orifício após o ponto de tubo de multiplicação de luz (PMT) ou dispositivo eletroacoplado frio (cCCD) Recebido ponto a ponto ou linha por linha, uma imagem fluorescente é rapidamente formada na tela do monitor do computador. O pinhole de iluminação e o pinhole de detecção em relação ao plano focal da lente objetiva são conjugados, o ponto no plano focal ao mesmo tempo focado no pinhole de iluminação e no pinhole de emissão, o ponto fora do plano focal não estará na detecção do pinhole na imagem, de modo que a imagem confocal obtida seja a seção transversal óptica da amostra, superando as deficiências da imagem difusa do microscópio comum.
Do princípio básico, o microscópio confocal a laser é um microscópio óptico moderno, é o microscópio óptico comum da tecnologia para fazer as seguintes melhorias.
1. Use o laser como fonte de luz porque a monocromaticidade do laser é muito boa, o comprimento de onda do feixe da fonte de luz é o mesmo, eliminando fundamentalmente a aberração cromática.
2. O uso de tecnologia confocal no plano focal da lente objetiva colocada no meio com um pequeno orifício no defletor, o plano focal fora do bloqueio de luz difusa, eliminando a aberração esférica; e eliminar ainda mais a aberração cromática.
3. Microscópio confocal a laser usando tecnologia de varredura pontual para decompor a amostra em espaço bidimensional ou tridimensional em inúmeros pontos, com um feixe de laser muito pequeno (fonte de luz pontual) ponto por ponto, imagem de varredura linha por linha e, em seguida, através a combinação de microcomputador de um plano inteiro ou imagem tridimensional. O microscópio de luz tradicional é uma fonte de luz de campo sob a imagem única, as amostras em cada ponto da imagem serão adjacentes ao ponto de luz difratada e interferência de luz espalhada. A clareza e a precisão destas duas imagens não podem ser comparadas.
4. Aquisição e processamento de sinais ópticos com computador e amplificação dos sinais com tubo fotomultiplicador
No microscópio confocal a laser, o computador substitui o olho humano ou câmera para observação e gravação de vídeo, e as imagens obtidas são digitalizadas e podem ser processadas no computador para melhorar novamente a clareza das imagens. Além disso, o uso de tubos fotomultiplicadores pode amplificar sinais muito fracos, melhorando bastante a sensibilidade. Como resultado do uso combinado das tecnologias acima, pode-se dizer que o LSCM é o microscópio mais avançado do mundo. Pode-se dizer que LSCM é a combinação de tecnologia de produção de microscópios, tecnologia fotoelétrica, tecnologia de informática **, é o produto inevitável do desenvolvimento da tecnologia moderna.
