Princípios da Microscopia de Fluorescência
Os microscópios de fluorescência são diferentes dos microscópios ópticos comuns. Em vez de observar espécimes sob a iluminação de fontes de luz comuns, eles usam luz de um determinado comprimento de onda (geralmente luz ultravioleta, luz azul-violeta) para excitar as substâncias fluorescentes nos espécimes sob o microscópio para fazê-los emitir fluorescência. Portanto, a fonte de luz de um microscópio de fluorescência não funciona como iluminação direta, mas como uma fonte de energia que excita as substâncias fluorescentes dentro do espécime. A razão pela qual podemos observar o espécime é devido à iluminação da fonte de luz, mas o fenômeno de fluorescência apresentado após a substância fluorescente no espécime absorver a energia luminosa excitada.
Pode-se ver que a característica do microscópio de fluorescência é que sua fonte de luz pode fornecer uma grande quantidade de luz de excitação em uma faixa de comprimento de onda específica, de modo que a substância fluorescente na amostra testada possa obter a luz de excitação da intensidade necessária. Ao mesmo tempo, o microscópio de fluorescência deve ter o sistema de filtro correspondente.
A microscopia de fluorescência é uma ferramenta essencial na histoquímica de imunofluorescência. É composto de fonte de luz de ultra-alta tensão, sistema de filtro (incluindo placa de filtro de excitação e supressão), sistema óptico e sistema de fotografia e outros componentes principais. Ele usa luz de um determinado comprimento de onda para excitar o espécime para emitir fluorescência.
A maneira de excitar a fluorescência: De acordo com a faixa de comprimento de onda da luz, ela pode ser dividida em dois tipos: método de excitação UV (usando o método de iluminação ultravioleta) e método de excitação BV (usando luz azul-violeta). O método de excitação UV usa luz quase ultravioleta menor que 400 nm para excitação. Não há luz de excitação visível neste método, então a fluorescência observada apresenta a fluorescência inerente do corante, e é fácil distinguir a fluorescência específica na amostra da autofluorescência do tecido de fundo.
O método de excitação BV é baseado em 404nm e 434nm para excitação de ultravioleta para luz azul. Este método usa luz azul para irradiar a amostra, portanto, o filtro de corte do sistema de observação de fluorescência deve usar um filtro que possa bloquear completamente a luz azul e passar totalmente pela fluorescência verde e amarela necessária. Corantes fluorescentes para ensaios de anticorpos fluorescentes. O comprimento de onda máximo de absorção da luz de excitação é relativamente próximo ao comprimento de onda máximo de emissão de fluorescência, portanto, o filtro usado no método de excitação BV deve usar um filtro de corte preciso. Este método pode usar luz azul como luz de excitação, de modo que a eficiência de absorção do pigmento fluorescente é maior e uma imagem mais brilhante pode ser obtida. Sua desvantagem é que a fluorescência abaixo de 500nm não pode ser vista, e a fluorescência acima de 500nm faz com que toda a imagem pareça amarela. No método de anticorpo fluorescente, a especificidade do fluorocromo é muitas vezes julgada pela cor exclusiva do fluorocromo. Portanto, ao discutir a especificidade sutil, as deficiências acima mencionadas do método de excitação BV geralmente têm uma grande influência.
Resumindo, a iluminação do microscópio de fluorescência pode ser considerada de acordo com os três pontos a seguir, de acordo com a estrutura do condensador e o comprimento de onda da luz de excitação.
① Do ponto de vista dos requisitos de contraste da imagem fluorescente, o concentrador de campo escuro de excitação UV é usado para iluminação.
② Considerando o brilho da imagem, o filtro de excitação BV tem a maior eficiência de observação de campo escuro.
③As características da observação de campo escuro do filtro de excitação UV e da iluminação do concentrador de campo escuro de excitação BV podem ser consideradas entre esses dois métodos de iluminação, mas o primeiro tem propriedades de campo escuro mais fortes e exibe imagens mais brilhantes. O contraste é pequeno; o último retém as propriedades do caminho de luz do campo escuro, de modo que a imagem exibida é mais escura e o contraste é aprimorado. Ao usar um microscópio de fluorescência, o método de iluminação que melhor se adapta aos requisitos da amostra deve ser usado para observação.
Deve-se ressaltar que mesmo que o condensador de campo escuro excitado por UV com o melhor contraste seja iluminado, parte da luz de excitação ultravioleta refratada ou espalhada pela amostra entrará na lente objetiva. A autofluorescência pode piorar a resposta da imagem. Portanto, um filtro de absorção de UV deve ser usado na frente da ocular como um filtro de corte.
