Preparação e observação de amostras biológicas para microscopia eletrônica
A resolução de um microscópio depende do comprimento de onda da luz utilizada. O microscópio eletrônico, que começou a surgir em 1933, utiliza como fonte de luz um feixe de elétrons com comprimento de onda muito menor que o da luz visível, de modo que a resolução que pode atingir é muito melhorada em comparação com a de um microscópio óptico. A diferença nas fontes de luz também determina uma série de diferenças entre microscópios eletrônicos e microscópios ópticos.
De acordo com as diferenças nos princípios da imagem por feixe de elétrons e nas diferentes formas de agir nas amostras, os microscópios eletrônicos modernos se desenvolveram em vários tipos. Atualmente, os mais utilizados são microscópios eletrônicos de transmissão e microscópios eletrônicos de varredura. A ampliação total do primeiro pode estar entre 1000-1000000. A ampliação total deste último pode variar entre 20 e 300,000 vezes. Este experimento apresenta principalmente a preparação de dois tipos de amostras de microscópio, microscópio eletrônico de transmissão e microscópio eletrônico de varredura.
2. Equipamento
1. Bactéria Escherichia coli (Escherichia coli) inclinada.
2. Solução ou reagente acetato de amila, ácido sulfúrico concentrado, etanol absoluto, água estéril, 2% de fosfotungstato de sódio (pH 6.5-8.0) solução aquosa, 0,3% de polietileno solução de formaldeído (solúvel em clorofórmio), células Pigmento c, acetato de amônio, plasmídeo pBR322.
3. Instrumentos ou outros utensílios: microscópio óptico comum, malha de cobre, funil de porcelana, copo, prato, conta-gotas estéril, pinça estéril, alfinetes, lâminas, quadro de contagem, máquina de revestimento a vácuo, secador de ponto crítico, etc.
3. Etapas de operação
(1) Preparação de amostras e observação para microscopia eletrônica de transmissão
1. Tratamento de malha metálica
A amostra para microscopia óptica é colocada em uma lâmina de vidro para observação. No entanto, na microscopia eletrônica de transmissão, uma vez que os elétrons não podem penetrar na folha de vidro, os materiais de malha só podem ser usados como transportadores, geralmente chamados de redes transportadoras. A malha transportadora pode ser dividida em muitas especificações diferentes devido aos diferentes materiais e formatos, entre os quais o mais comumente usado é a malha de cobre 200-400 (número de furos). A malha de cobre deve ser tratada antes do uso para remover sujeira e mantê-la limpa, caso contrário afetará a qualidade do filme de suporte e a clareza das fotos do espécime. Este experimento usa uma malha de cobre 400-, que pode ser tratada da seguinte forma: primeiro, mergulhe e alveje com acetato de amila por várias horas, depois enxágue com água destilada várias vezes e depois mergulhe em etanol absoluto por desidratação. Se a malha de cobre ainda não estiver limpa após os métodos acima, você pode mergulhá-la em ácido sulfúrico concentrado diluído (1:1) por 1 a 2 minutos, ou fervê-la em solução de NaOH a 1% por alguns minutos, enxaguar com destilado regue várias vezes e depois coloque em desidratado anidro em etanol e reserve.
2. Preparação da membrana de suporte
Ao observar amostras, a rede transportadora também deve ser coberta com uma camada de filme uniforme e não estruturado, caso contrário, pequenas amostras vazarão dos orifícios da rede transportadora. Este filme é geralmente chamado de filme de suporte ou filme transportador. O filme de suporte deve ser transparente a elétrons e sua espessura geralmente deve ser inferior a 20 nm; sob o impacto do feixe de elétrons, o filme também deve ter uma certa resistência mecânica para manter a estabilidade estrutural e ter boa condutividade térmica; além disso, a rede de suporte deve ser utilizada em microscopia eletrônica. Não deve haver nenhuma estrutura visível por baixo, nenhuma reação química com a amostra transportada e nenhuma interferência na observação da amostra. Sua espessura é geralmente de cerca de 15 nm. O filme de suporte pode ser filme plástico (como filme de colódio, filme de polietileno formaldeído, etc.), filme de carbono ou filme de metal (como filme de berílio, etc.). Sob condições normais de trabalho, o filme plástico pode atender aos requisitos. Entre os filmes plásticos, o filme de colódio é relativamente fácil de preparar, mas sua resistência não é tão boa quanto o filme de polietileno formaldeído.
