Tecnologia de imagem de microscopia multifotônica: polarização-microscopia de geração de segundo harmônico-resolvida por polarização e seu processamento de imagem
Em microscópios ópticos não lineares, a imagem de geração de segundo harmônico (SHG) é comumente usada para observar estruturas fibrosas endógenas, e a intensidade do SHG depende em grande parte do ângulo relativo entre a direção de polarização do feixe incidente e o eixo de orientação da molécula alvo. Portanto, a imagem SHG baseada em polarização (P-SHG) pode obter informações estruturais de moléculas alvo analisando a relação funcional entre a intensidade do sinal SHG e o estado de polarização do feixe incidente. Agora é usado como uma ferramenta importante para análises médicas e biológicas.
Imagens SHG simples podem ser obtidas por meio da tradicional microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons (TPM). A maioria dos sistemas TPM ainda usa um método de varredura de feixe único baseado em um espelho móvel, cuja resolução temporal depende da velocidade de movimento físico do espelho. Para obter imagens mais rápidas, o sistema TPM também pode adotar um método de varredura multifeixe (Figura 1A), um dos quais é usar uma unidade de varredura de disco rotativo. Esta unidade consiste em uma mesa giratória de microlente coaxial e uma mesa giratória pinhole, com as microlentes e furos em cada mesa giratória correspondendo um-a-um.
Quando o laser passa pela plataforma giratória de microlentes, a frente de onda cobre várias microlentes. Diferentes microlentes focam diferentes partes da frente de onda em diferentes posições e passam através de orifícios correspondentes, formando múltiplos microfeixes. Esses microfeixes que atingem a amostra podem excitar simultaneamente vários sinais. Esses sinais retornam ao longo do sistema do microscópio e passam novamente pelo orifício, sendo finalmente refletidos pelo espelho dicróico entre as duas plataformas giratórias para o dispositivo de detecção. No entanto, o modo comumente usado-laser de safira de titânio bloqueado como fonte de luz tem energia insuficiente, o que limita o número de feixes de excitação e resulta em um pequeno campo de visão efetivo (FOV) para TPM (TPM-SD) usando uma unidade de varredura rotativa.
Ai Goto et al. teve como objetivo obter imagens P-SHG de alta-velocidade com um grande campo de visão (FOV) usando o sistema TPM-SD. Portanto, uma fonte de laser baseada em Yb com maior potência de pico foi introduzida no sistema TPM-SD.
Este é um diagrama esquemático do sistema-SD TPM que eles desenvolveram. A fonte de luz do sistema é um laser baseado em Yb, que gera pulsos de femtossegundos com comprimento de onda central de 1042 nm, potência média de 4 W, largura de pulso de 300 fs e taxa de repetição de 10 MHz. O sistema primeiro ajusta a potência do laser através de uma placa de meia onda e um polarizador de laser Glan e, em seguida, expande o feixe através de um expansor de feixe. O feixe expandido é introduzido na unidade de varredura da base giratória e vários microfeixes que saem da unidade de varredura são focados em vários pontos da amostra através de uma lente objetiva de imersão em água. Para ajustar o estado de polarização do feixe de luz na lente objetiva, uma placa de meia onda e uma placa de quarto de onda são colocadas no caminho óptico do feixe de excitação.
