Microscopia Confocal a Laser - Recursos e Aplicações
A microscopia confocal de varredura a laser (LSCM) é um tipo de microscópio projetado com base na tecnologia de foco conjugado, ou seja, a fonte de luz laser, a amostra a ser medida e o detector estão todos em posições conjugadas entre si.
Fundamental
Em um microscópio geral, o plano de observação da imagem é isolado do plano axial adjacente, coincidindo o plano focal da lente objetiva com o detector, enquanto em um microscópio confocal, um ponto de luz limitado por difração é usado para iluminar a amostra e um pinhole é usado no caminho de luz coletado no foco conjugado do ponto de luz para filtrar a luz dispersa para criar esse efeito de isolamento e, assim, melhorar a resolução.
Recursos de imagem
Imagem de varredura de seção óptica
Outra característica da microscopia confocal de varredura a laser é que ela é uma tecnologia de imagem de varredura. A tecnologia tradicional de iluminação de campo amplo ilumina toda a amostra, de modo que a imagem pode ser capturada diretamente a olho nu ou por um detector, mas o LSCM usa um feixe ou vários feixes focados passam pela amostra para digitalizar e gerar imagens. A imagem resultante é chamada de seção óptica. O seguinte mostra a diferença entre o método tradicional de iluminação de campo amplo e o método de iluminação confocal por varredura a laser.
Portanto, um método de trabalho real de um microscópio confocal moderno é mostrado na figura abaixo. A luz de excitação emitida pelo laser passa através de um espelho dicróico e é varrida na direção xey da amostra através de um par de galvanômetros. A excitação (ou reflexão) da amostra é A luz entra no detector PMT através do orifício e é registrada, e a imagem digitalizada gravada é reconstruída por um computador para reconstruir a imagem real da amostra.
Gere imagens "z-stack" em diferentes planos focais
Somente a luz refletida da camada de amostra conjugada pode passar através do pequeno orifício no caminho da luz de coleta, e os reflexos irrelevantes restantes da camada de amostra são bloqueados pelo pequeno orifício. Isso pode resultar em melhorias significativas na resolução. Comparação lado a lado de microscopia de fluorescência multidimensional e microscopia confocal da mesma amostra espessa. Quando uma série de imagens são tiradas em diferentes planos focais, podem ser geradas imagens comumente chamadas de "pilhas z", que ilustram os ganhos de resolução e contraste oferecidos pela microscopia confocal e as causas subjacentes desses ganhos. Pode-se observar que o exame da imagem no topo da pilha com o plano de imagem acima do tecido revela uma grande quantidade de luz dispersa na imagem de fluorescência, enquanto a imagem da microscopia confocal aparece preta. Esta redução no PSF axial resulta diretamente na diferença de resolução observada na interface óptica no meio da pilha z.
A resolução é bastante melhorada em comparação com a iluminação de campo amplo
Na microscopia de fluorescência, a intensidade da luz emitida por um único ponto é descrita pela função de dispersão pontual (PSF), e seu padrão é um disco Airy. A resolução do sistema de fluorescência pode ser descrita pelo raio do disco Airy, que pode ser descrito por A abertura numérica da lente objetiva e o comprimento de onda da luz de excitação determinam
