Conhecimento sobre microscopia de fluorescência de dois{0}fótons
O princípio básico da excitação de dois-fótons é que, em alta densidade de fótons, as moléculas fluorescentes podem absorver simultaneamente dois fótons de comprimento de onda longo e emitir um fóton de comprimento de onda mais curto após um curto período do-chamado tempo de vida do estado excitado; O efeito é o mesmo que usar um fóton com metade do comprimento de onda do comprimento de onda longo para excitar moléculas fluorescentes. A excitação de dois fótons requer uma alta densidade de fótons e, para evitar danos às células, a microscopia de dois{3}fótons usa lasers de pulso bloqueados em-modo de alta energia-. O laser emitido por este laser possui alta energia de pico e baixa energia média, com largura de pulso de apenas 100 femtossegundos e frequência de até 80 a 100 megahertz. Ao usar uma lente objetiva de alta abertura numérica para focar os fótons de um laser pulsado, a densidade de fótons no ponto focal da lente objetiva é a mais alta, e a excitação de dois-fótons ocorre apenas no ponto focal da lente objetiva. Portanto, o microscópio de dois{13}fótons não requer um orifício confocal, o que melhora a eficiência da detecção de fluorescência.
Nos fenómenos gerais de fluorescência, devido à baixa densidade de fotões da luz de excitação, uma molécula fluorescente só pode absorver um fotão de cada vez e depois emitir outro fotão fluorescente através de transição radiativa, que é conhecida como fluorescência de fotão único. Para processos de excitação de fluorescência usando lasers como fontes de luz, podem ocorrer fenômenos de fluorescência de dois-fótons ou mesmo multifótons. Neste caso, a fonte de luz de excitação utilizada possui alta intensidade e densidade de fótons que atende ao requisito das moléculas fluorescentes absorverem dois fótons simultaneamente. No processo de utilização de um laser geral como fonte de luz de excitação, a densidade de fótons ainda é insuficiente para produzir o fenômeno de absorção de dois-fótons. Normalmente, são usados lasers de pulso de femtossegundos, com potência instantânea atingindo o nível de megawatts. Portanto, o comprimento de onda da fluorescência de dois -fótons é mais curto do que o da luz de excitação, equivalente ao efeito produzido pela excitação de meio comprimento de onda de excitação.
