Introdução à Microscopia de Fluorescência
A microscopia de fluorescência é irradiar o objeto corado com fluoresceína com luz de comprimento de onda curto, de modo que seja excitado para produzir fluorescência de comprimento de onda longo e depois observado. Em um microscópio de fluorescência, a luz de excitação de um comprimento de onda específico deve ser selecionada da luz de iluminação da amostra para gerar fluorescência e, em seguida, a fluorescência deve ser separada da luz mista da luz de excitação e da fluorescência para observação. Portanto, o sistema de filtro desempenha um papel extremamente importante na seleção de um comprimento de onda específico. Microscópios de fluorescência são amplamente utilizados em biologia, medicina e outros campos.
1. Os principais componentes do microscópio de fluorescência:
(A) Fonte de luz: A fonte de luz irradia luz de vários comprimentos de onda (do ultravioleta ao infravermelho). o
(B) Fonte de luz do filtro de excitação: através da luz de um comprimento de onda específico que pode fazer com que o espécime produza fluorescência, enquanto bloqueia a luz que é inútil para excitar a fluorescência. o
(C) Espécimes fluorescentes: geralmente corados com pigmentos fluorescentes. o
(D) Filtro de bloqueio: bloqueia a luz de excitação que não é absorvida pela amostra e transmite seletivamente a fluorescência, e alguns comprimentos de onda são transmitidos seletivamente na fluorescência.
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2. Classificação dos microscópios de fluorescência:
Os microscópios de fluorescência são geralmente divididos em dois tipos: transmissão e epi-emissão:
a. Tipo de transmissão: a luz de excitação vem do fundo do objeto a ser inspecionado e o condensador é um condensador de campo escuro, de modo que a luz de excitação não entra na lente objetiva, mas a fluorescência entra na lente objetiva. É brilhante em baixas ampliações, mas escuro em altas ampliações. É difícil operar em imersão em óleo e centralização. É especialmente difícil determinar a faixa de iluminação em ampliações baixas, mas pode obter um fundo de campo de visão muito escuro. O tipo de transmissão não é usado para objetos não transparentes. o
b. Epi-tipo: O tipo de transmissão é quase eliminado atualmente. A maioria dos novos microscópios de fluorescência são do tipo epi. A fonte de luz vem de cima do objeto a ser inspecionado e há um divisor de feixe no caminho óptico, portanto, é adequado para objetos transparentes e opacos a serem inspecionados. Uma vez que a lente objetiva atua como uma lente condensadora, não é apenas fácil de operar, mas também pode obter iluminação uniforme de todo o campo de visão, de baixa a alta ampliação. o
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3. Precauções para fluoroscopia
a. A irradiação de longo prazo da luz de excitação causará atenuação e extinção da fluorescência, portanto, reduza o tempo de observação o máximo possível e use um defletor para cobrir a luz de excitação quando não estiver observando temporariamente. o
b. Ao observar com uma lente de imersão em óleo, use "óleo não fluorescente". o
c. A fluorescência é quase sempre fraca e deve ser realizada em uma sala escura. o
d. É melhor instalar um estabilizador de tensão na fonte de alimentação, caso contrário, a tensão instável não apenas reduzirá a vida útil da lâmpada de mercúrio, mas também afetará o efeito da inspeção do microscópio. o
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4. Uso de Microscopia de Fluorescência
1. Requisitos de preparação para amostras de microscópio de fluorescência
a. lâmina de vidro
A espessura da lâmina de vidro deve estar entre 0,8 e 1,2 mm. Por um lado, uma lâmina muito espessa absorverá mais luz e, por outro lado, a luz de excitação não poderá ser concentrada na amostra. As lâminas devem ser lisas, uniformes em espessura e livres de autofluorescência óbvia. Às vezes, lâminas de vidro de quartzo são usadas. o
b. Tampa de vidro
A espessura da tampa de vidro é de cerca de 0,17 mm, lisa. Para fortalecer a luz de excitação, também pode ser usado um vidro de cobertura seco, que é um vidro de cobertura especial revestido com várias camadas de substâncias (como fluoreto de magnésio) que têm diferentes efeitos de interferência na luz de diferentes comprimentos de onda, o que pode tornar o fluorescência ir sem problemas. A luz de excitação é passada e a luz de excitação refletida excita a amostra. o
c. espécime
Fatias de tecido ou outras amostras não devem ser muito grossas. Se for muito espesso, a maior parte da luz de excitação será consumida na parte inferior da amostra, enquanto a parte superior observada diretamente pela lente objetiva não pode ser totalmente excitada. Além disso, a sobreposição de células ou as impurezas encobrem, afetando o julgamento. o
d. agente de montagem
A glicerina é comumente usada como agente de montagem, que não deve ter autofluorescência, incolor e transparente, e o brilho da fluorescência é mais brilhante em pH 8.5-9.5, e não é fácil desbotar rapidamente. Portanto, uma mistura igual de glicerol e 0.5mol/L de solução tampão de carbonato com um pH de 9.0 a 9,5 é comumente usada como agente de montagem. o
e. óleo de espelho
Geralmente, o óleo de imersão deve ser usado ao observar amostras com microscópios de fluorescência de campo escuro e objetivas de imersão em óleo. É melhor usar óleo de espelho especial não fluorescente, que também pode ser substituído pela glicerina mencionada acima, e também pode ser usada parafina líquida, mas o índice de refração é baixo, o que afeta um pouco a qualidade da imagem.
