Conhecimento relacionado ao microscópio de fluorescência
O princípio básico da microscopia de fluorescência confocal: uma fonte de luz pontual é usada para irradiar a amostra e um pequeno ponto de luz bem definido é formado no plano focal. composto por divisores. O divisor de feixe envia a fluorescência diretamente para o detector. Há um orifício na frente da fonte de luz e do detector, chamados respectivamente de orifício de iluminação e orifício de detecção. O tamanho geométrico dos dois é o mesmo, cerca de 100-200 nm; em relação ao ponto de luz no plano focal, os dois são conjugados, ou seja, o ponto de luz passa por uma série de lentes e, finalmente, pode ser focado no orifício de iluminação e no orifício de detecção ao mesmo tempo. Desta forma, a luz do plano focal pode convergir dentro do escopo do orifício de detecção, enquanto a luz espalhada de cima ou abaixo do plano focal é bloqueada fora do orifício de detecção e não pode ser visualizada. O laser varre a amostra ponto a ponto, e o tubo fotomultiplicador após detectar o pinhole também obtém a imagem confocal do ponto de luz correspondente ponto a ponto, que é convertido em um sinal digital e transmitido ao computador e, finalmente, agregado em um claro imagem confocal de todo o plano focal na tela.
Cada imagem do plano focal é, na verdade, uma seção transversal óptica do espécime, e essa seção transversal óptica sempre tem uma certa espessura, também conhecida como seção delgada óptica. Como a intensidade da luz no ponto focal é muito maior do que no ponto sem foco, e a luz do plano não focal é filtrada pelo orifício, a profundidade de campo do sistema confocal é aproximadamente zero e a varredura ao longo do Z -eixo pode realizar tomografia óptica, formando um Observar a seção óptica bidimensional no ponto focalizado da amostra. Combinando a varredura do plano XY (plano focal) com a varredura do eixo Z (eixo óptico), a imagem tridimensional da amostra pode ser obtida acumulando imagens bidimensionais de camadas contínuas e processadas por um software de computador especial.
Ou seja, o pinhole de detecção e o pinhole da fonte de luz são sempre focados no mesmo ponto, de modo que a fluorescência excitada fora do plano focal não pode entrar no pinhole de detecção.
A expressão simples do princípio de funcionamento do laser confocal é que ele usa a luz do laser como fonte de luz. Com base na imagem tradicional do microscópio de fluorescência, ele adiciona um dispositivo de varredura a laser e um dispositivo de foco conjugado, e é um sistema para aquisição e processamento de imagens digitais por meio de controle de computador.
