Contagem direta de microrganismos com microscópio
Princípio experimental
A contagem direta sob um microscópio usando um hemocitômetro é um método de contagem microbiana comumente usado. A vantagem deste método é que ele é intuitivo e rápido. Coloque a suspensão bacteriana adequadamente diluída (ou suspensão de esporos) na câmara de contagem entre a lâmina e a tampa de vidro do hemocitômetro e conte ao microscópio. Como o volume da câmara de contagem é fixo (00,1 mm2), ele pode ser convertido no número total de microrganismos por unidade de volume de acordo com o número de microrganismos observados ao microscópio. Como esse método conta a soma de bactérias vivas e mortas, também é chamado de método de contagem total de bactérias.
Um hemocitômetro é geralmente uma lâmina de vidro especial na qual quatro ranhuras formam três plataformas. A plataforma central é dividida em duas metades por uma pequena ranhura horizontal. Uma grade está gravada na plataforma de cada lado. Cada grade é dividida em nove grandes quadrados. O grande quadrado no meio é a sala de contagem. Os microrganismos são contados na câmara de contagem. A estrutura do quadro de contagem de células sanguíneas é mostrada na Figura Ⅷ-1.
A escala da sala de contagem geralmente tem duas especificações, uma é que um quadrado grande é dividido em 16 quadrados médios e cada quadrado médio é dividido em 25 quadrados pequenos (Figura Ⅷ-2); o outro é um grande quadrado. O quadrado é dividido em 25 quadrados intermediários, e cada quadrado intermediário é dividido em 16 quadrados pequenos (Figura Ⅷ-1, C). Mas não importa que tipo de tabuleiro de contagem seja, o número de quadrados pequenos em cada quadrado grande é o mesmo, ou seja, 16×25=400 quadrados pequenos, conforme mostrado na Figura Ⅷ-2.
O comprimento lateral de cada quadrado grande é 1 mm e a área de cada quadrado grande é 1 mm2. Depois que a lamela é coberta, a altura entre a lâmina de vidro e a lamela é de 0,1 mm, então o volume da câmara de contagem é de 0,1mm3.
Ao contar, geralmente conte o número total de bactérias nas cinco grades intermediárias, em seguida, obtenha o valor médio de cada grade intermediária e, em seguida, multiplique por 16 ou 25 para obter o número total de bactérias em uma grade grande e, em seguida, converta para o número total de bactérias em 1ml de solução bacteriana.
Equipamento de laboratório
Hemocitômetro, microscópio, lamínula, capilar estéril;
Materiais Experimentais
Suspensão de Saccharomyces cerevisiae
Procedimento experimental (método de contagem direta de microscópio microbiano)
1. diluição
Dilua adequadamente a suspensão de Saccharomyces cerevisiae. Se a solução bacteriana não for espessa, não precisa ser diluída.
2. Sala de contagem microscópica
Antes de adicionar amostras, realize uma inspeção microscópica da câmara de contagem da placa de contagem. Se houver sujeira, ela deverá ser limpa antes da contagem.
3. adicione amostra
Cubra a placa do hemocitômetro limpa e seca com uma lamínula e, em seguida, use um conta-gotas estéril de boca fina para deixar cair uma pequena gota da solução diluída de Saccharomyces cerevisiae da borda da lamela (não muito), para que a solução bacteriana está perto da lacuna ao longo da lacuna. A osmose capilar entra sozinha na câmara de contagem, e a câmara de contagem geral pode ser preenchida com líquido bacteriano. Tenha cuidado para não formar bolhas de ar.
4. contagem de microscópio
Depois de descansar por 5 minutos, coloque o hemocitômetro na platina do microscópio, primeiro use uma lente de baixa potência para encontrar a localização da câmara de contagem e depois mude para uma lente de alta potência para contagem. Se for constatado que a solução bacteriana é muito espessa ou muito fina antes da contagem, é necessário reajustar a diluição antes da contagem. Geralmente, a diluição da amostra requer cerca de 5-10 bactérias em cada célula. Cada câmara de contagem seleciona as bactérias em 5 grades intermediárias (4 cantos opcionais e grades centrais) para contagem. As bactérias na linha da grade geralmente são contadas apenas nas linhas superior e direita. No caso de brotamento de levedura, quando o tamanho do corpo do botão atinge metade da célula-mãe, conte duas bactérias. Conte uma amostra para calcular o conteúdo bacteriano da amostra a partir dos valores contados nas duas câmaras de contagem.
5. Limpeza do Hemocitômetro
Após o uso, enxágue a placa de contagem de células sanguíneas da torneira com jatos de água, não lave com objetos duros e seque você mesmo ou com secador de cabelo após a lavagem. Exame microscópico, observe se há bactérias residuais ou outros sedimentos em cada célula. Se não estiver limpo, deve ser lavado repetidamente até ficar limpo.
