Diferenças e características entre microscópios de fluorescência e microscópios ópticos comuns
O microscópio de fluorescência é diferente do microscópio óptico comum porque não observa amostras sob a iluminação de fontes de luz comuns. Em vez disso, ele usa um determinado comprimento de onda de luz (geralmente luz ultravioleta, luz azul violeta) para excitar as substâncias fluorescentes dentro da amostra sob o microscópio, fazendo com que emitam fluorescência. Portanto, o papel da fonte de luz no microscópio de fluorescência não é a iluminação direta, mas como fonte de energia para excitar as substâncias fluorescentes dentro da amostra. A razão pela qual podemos observar amostras não é devido à iluminação da fonte de luz, mas ao fenômeno de fluorescência exibido pelas substâncias fluorescentes dentro da amostra após absorver a energia luminosa excitada. A partir disso, pode-se observar que a característica da microscopia de fluorescência é principalmente que sua fonte de luz pode fornecer uma grande quantidade de luz de excitação em uma faixa específica de comprimento de onda, de modo que as substâncias fluorescentes na amostra possam obter a intensidade necessária de luz de excitação. Ao mesmo tempo, os microscópios de fluorescência devem ter sistemas de filtros correspondentes. O microscópio de fluorescência é uma ferramenta fundamental na química dos tecidos de fluorescência. Ele é composto de componentes principais, como uma fonte de luz de ultra{7}}alta tensão, um sistema de filtro (incluindo placas de filtro de excitação e supressão), um sistema óptico e um sistema de fotografia. Ele usa luz de um determinado comprimento de onda para excitar a amostra e emitir fluorescência.
1. Métodos de excitação de fluorescência: De acordo com a faixa de comprimento de onda da luz, existem dois tipos: método de excitação UV (usando iluminação ultravioleta) e método de excitação BV (usando luz azul violeta). O método de excitação UV usa luz quase ultravioleta menor que 400 nm para excitação. Este método não possui luz de excitação visível, portanto a fluorescência observada exibe a fluorescência inerente do corante, facilitando a distinção entre a fluorescência específica na amostra e a autofluorescência do tecido de fundo.
2. Método de excitação BV: Envolve excitação de luz ultravioleta para luz azul centrada em 404 nm e 434 nm. Este método usa luz azul para irradiar a amostra, portanto, o filtro-de corte do sistema de observação de fluorescência deve usar um filtro que possa bloquear completamente a luz azul e passar completamente pela fluorescência verde e amarela necessária. Pigmentos fluorescentes usados para método de anticorpo fluorescente. O comprimento de onda máximo de absorção da luz de excitação e o comprimento de onda máximo de emissão da fluorescência são relativamente próximos, portanto, o filtro usado no método de excitação BV deve usar um filtro de corte nítido. Este método pode usar luz azul como luz de excitação, de modo que a eficiência de absorção dos pigmentos fluorescentes é alta e imagens mais brilhantes podem ser obtidas. A desvantagem é que a fluorescência abaixo de 500 nm não pode ser vista, enquanto a fluorescência acima de 500 nm faz com que toda a imagem pareça amarela. No método do anticorpo fluorescente, a especificidade é determinada principalmente pela cor exclusiva dos pigmentos fluorescentes, portanto, ao discutir a especificidade sutil, as desvantagens do método de excitação BV mencionados acima têm frequentemente um impacto significativo.
