Diferenças e vantagens e desvantagens entre microscopia de fluorescência de transmissão e microscopia de fluorescência de reflexão
1. Microscópio de fluorescência de transmissão: A fonte de luz de excitação é transmitida através do material da amostra através de um condensador para excitar a fluorescência. Concentradores de campo escuro comumente usados, ou concentradores comuns, podem ser usados para ajustar o refletor para converter a luz de excitação e a luz lateral na amostra. Este é um microscópio de fluorescência relativamente antiquado. Sua vantagem é a forte fluorescência em baixa ampliação, enquanto sua desvantagem é que sua fluorescência enfraquece com o aumento da ampliação. Portanto, é melhor observar materiais de amostras maiores.
2. Microscópio de fluorescência de feixe descendente: Este é um novo tipo de microscópio de fluorescência que se desenvolveu nos tempos modernos. Ao contrário do anterior, a luz de excitação cai da lente objetiva sobre a superfície da amostra, usando a mesma lente objetiva do condensador de iluminação e a lente objetiva para coletar a fluorescência. Um separador de feixe de duas cores precisa ser adicionado ao caminho óptico, que forma um ângulo de 45 graus com o fotourânio. A luz de excitação é refletida na lente objetiva e acumulada na amostra. A fluorescência gerada pela amostra e a luz de excitação refletida na superfície da lente objetiva e da tampa de vidro entram simultaneamente na lente objetiva e retornam ao separador de feixe de duas cores, separando a luz de excitação e a fluorescência. A luz de excitação residual é então absorvida pelo filtro de bloqueio. Se forem usadas diferentes combinações de filtros de excitação, separadores de feixe de duas cores e filtros de bloqueio, eles poderão atender às necessidades de diferentes produtos de reação fluorescente. As vantagens deste microscópio fluorescente são iluminação uniforme do campo de visão, imagens nítidas e fluorescência mais forte com maior ampliação.
As vantagens e desvantagens da microscopia de fluorescência de transmissão
Fonte de luz: Lâmpada de mercúrio de alta pressão ou lâmpada halógena.
Espelho de holofote: Usando um holofote de campo escuro para separar excitação e fluorescência.
Lente objetiva: Qualquer tipo de lente objetiva pode ser usada.
Amostra: Amostras finas são mais adequadas para observação de transmissão.
Vantagens: ① Devido ao uso de um condensador de campo escuro, a luz de excitação não pode entrar na lente objetiva, facilitando a formação de um fundo escuro e obtendo um bom contraste, e qualquer lente objetiva pode ser usada para observação. ② Ao usar uma objetiva de baixa ampliação, ela é mais brilhante que um microscópio de fluorescência reflexivo.
Desvantagem: O centro e a altura do holofote devem ser ajustados corretamente, caso contrário não será possível obter uma imagem fluorescente brilhante. Devido à limitação da distância focal do refletor de campo escuro, não podem ser utilizadas lâminas de vidro espessas. A área de iluminação do campo de visão não deve ser muito grande, caso contrário, poderá causar o desbotamento da cor fluorescente da amostra fluorescente. Amostras espessas ou opacas não são adequadas.
As vantagens e desvantagens da microscopia de fluorescência reflexiva
Fonte de luz: Lâmpada de mercúrio de alta pressão ou lâmpada halógena.
Lente de foco: Como a lente objetiva serve como lente de foco, não há necessidade de lente de foco.
Lente objetiva: A lente objetiva utilizada deve ser capaz de transmitir luz ultravioleta suficiente e não produzir fluorescência em si, sem limitação de abertura numérica.
Espécime: Podem ser observados espécimes espessos e opacos.
Vantagens: ① Como a lente objetiva também serve como holofote, ela não requer muitos ajustes. ② Ao usar o método de iluminação Kolar, os efeitos da abertura e das aberturas do campo de visão podem ser utilizados. A abertura numérica da lente objetiva não é limitada e imagens de alta resolução também podem ser obtidas com alta ampliação. Amostras espessas ou opacas também podem ser observado, e lamínulas grossas também podem ser usadas. Outros métodos de observação também podem ser combinados com fluorescência refletida, especialmente com método de diferença de fase e método de interferência diferencial de transmissão. Ele pode evitar o fenômeno desnecessário de desbotamento da cor da fluorescência.
Desvantagem: Ao usar uma objetiva de ampliação terrestre, a imagem é relativamente escura, portanto, uma objetiva de alta abertura numérica deve ser usada. O sistema de filtro deve separar efetivamente a luminescência e a fluorescência de excitação.,
