Comparação entre microscópio confocal e microscópio óptico comum
Microscópio óptico geral
O microscópio biológico geral consiste em três partes, a saber: ① sistema de iluminação, incluindo fonte de luz e condensador; ② O sistema de amplificação óptica, que consiste em lente objetiva e ocular, é o corpo principal do microscópio. Para eliminar a aberração esférica e a aberração cromática, tanto a ocular quanto a lente objetiva são compostas por grupos de lentes complexos; (3) dispositivo mecânico, utilizado para fixação de materiais e observação conveniente.
Se a imagem do microscópio é nítida ou não, depende não apenas da ampliação, mas também da resolução do microscópio. Resolução refere-se à capacidade do microscópio (ou do local onde os olhos humanos estão a 25 cm do alvo) de distinguir o pequeno intervalo do objeto zui. A resolução depende do comprimento de onda da luz, da relação de abertura e do índice de refração do meio, que é expresso pela fórmula:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Onde: n= índice de refração do meio;=ângulo do espelho (o ângulo de abertura da amostra em relação à abertura da lente) e abertura numérica NA=. O ângulo do espelho é sempre menor que 180? Portanto, o valor zui de sina/2 deve ser menor que 1.
O índice de refração do vidro usado para fazer lentes ópticas é de 1,65 ~ 1,78, e o índice de refração do meio utilizado é mais próximo do vidro, melhor. Para lentes objetivas secas, o meio é o ar e a taxa de abertura é geralmente 0.05 ~ 0,95; A lente de óleo usa asfalto perfumado como meio, e a taxa de abertura da lente pode ser próxima de 1,5.
O comprimento de onda da luz comum é 400~700nm, então a resolução do microscópio não é inferior a 0,2μm, e a resolução do olho humano é 0,2mm, então a grande ampliação do zui projetada por microscópio geral é geralmente 1000X x.
Por que você precisa de um microscópio confocal?
1. O microscópio óptico foi aperfeiçoado através dos esforços e melhorias de nossos grandes antecessores. Na verdade, os microscópios comuns podem nos fornecer belas imagens microscópicas de forma simples e rápida. Porém, aconteceu um evento que trouxe inovação revolucionária a este mundo quase perfeito dos microscópios, que é a invenção do “microscópio confocal de varredura a laser”. Este novo microscópio caracteriza-se por adotar um sistema óptico que apenas extrai a informação da imagem no plano onde o foco está concentrado, e restaura a informação obtida na memória da imagem enquanto muda o foco, para que uma imagem vívida com informação tridimensional completa pode ser obtido. Através deste método, informações sobre o formato da superfície que não podem ser confirmadas por microscópios comuns podem ser obtidas simplesmente. Além disso, para microscópios ópticos comuns, "melhorar a resolução" e "aprofundar a profundidade de foco" são condições contraditórias, especialmente em grandes ampliações, mas para microscópios confocais esse problema está resolvido.
2. Vantagens do sistema óptico confocal
O sistema óptico confocal ilumina o ponto de amostra e a luz refletida também é recebida pelos receptores pontuais. Quando a amostra é colocada na posição de foco, quase toda a luz refletida pode atingir o fotorreceptor, mas quando a amostra se desvia do foco, a luz refletida não consegue atingir o fotorreceptor. Ou seja, no sistema óptico confocal, apenas a imagem que coincide com o foco será emitida, e a fácula e a luz dispersa inútil serão protegidas.
3. Por que usar um laser?
No sistema óptico confocal, a amostra é iluminada e a luz refletida também é recebida por um fotorreceptor pontual. Portanto, a fonte de luz pontual torna-se necessária. O laser pertence a uma fonte de luz muito pontual. Na maioria dos casos, a fonte de luz do microscópio confocal adota uma fonte de luz laser. Além disso, as características do laser, como monocromaticidade, diretividade e excelente formato do feixe, também são razões importantes para sua ampla utilização.
4. A observação em tempo real baseada na varredura de alta velocidade torna-se possível.
Na varredura a laser, o Defletor Óptico Acústico (elemento principal AO) é utilizado na direção horizontal e o espelho Servo Galvano é utilizado na direção vertical. Por não haver parte de vibração mecânica na unidade de deflexão óptica acústica, ela pode fazer a varredura em alta velocidade, sendo possível observar em tempo real na tela de monitoramento. A alta velocidade desta câmera é um projeto muito importante que afeta diretamente a velocidade de foco e recuperação de posição.
5. Relação entre posição de foco e brilho
No sistema óptico confocal, quando a amostra é colocada corretamente na posição de foco, o brilho é grande, e antes e depois, seu brilho cairá drasticamente (linha sólida na Figura 4). Essa seletividade sensível do plano focal também é o princípio de medir a direção da altura do microscópio confocal e expandir a profundidade focal. Em contraste, o microscópio óptico comum não apresenta mudança óbvia de brilho antes e depois da posição do foco (linha pontilhada na Figura 4).
6. Alto contraste e alta resolução
No microscópio óptico geral, a luz refletida que se desvia do foco irá interferir e se sobrepor à parte da imagem do foco, reduzindo assim o contraste da imagem. Em contraste, no sistema óptico confocal, a luz espalhada fora do foco e a luz espalhada dentro da lente objetiva são quase completamente removidas, de modo que uma imagem com contraste muito alto pode ser obtida. Além disso, como a luz passa duas vezes pela lente objetiva, a imagem pontual é mais nítida primeiro e a resolução do microscópio também é melhorada.
7. Função de localização óptica
No sistema óptico confocal, a luz refletida da outra parte que não o ponto focal é protegida por microporos. Portanto, ao observar uma amostra tridimensional, forma-se uma imagem semelhante à formada após o fatiamento da amostra com o foco (Figura 5). Este efeito é denominado localização óptica, que pertence a uma das especialidades do sistema óptico confocal.
8. Função de memória móvel de foco
A chamada luz refletida fora do foco é protegida pelos microporos. Por outro lado, pode-se considerar que todos os pontos da imagem formada pelo sistema óptico confocal coincidem com o foco. Portanto, se a amostra tridimensional for movida ao longo da direção do eixo Z (eixo óptico), a imagem será acumulada e armazenada na memória, e o zui eventualmente obterá a imagem formada pela coincidência de toda a amostra e do foco . Desta forma, a função de profundidade de foco infinita é chamada de função de memória móvel.
9. Função de medição do formato da superfície
Na função de movimento de foco, o formato da superfície da amostra pode ser medido sem contato, adicionando um loop de registro de altura. Com base nesta função, é possível registrar as coordenadas do eixo Z formadas pelo grande valor de brilho de zui em cada pixel, e com base nessas informações, podem ser obtidas as informações relacionadas ao formato da superfície da amostra.
10. Função de medição de microtamanho de alta precisão
A unidade receptora de luz adota um sensor de imagem CCD unidimensional, de modo que não pode ser afetada pela inclinação de digitalização do dispositivo de digitalização, para que a medição de alta precisão possa ser concluída. Além disso, como a função de memória móvel de foco com profundidade de foco ajustável é adotada ao mesmo tempo, o erro de medição causado pelo deslocamento de foco pode ser eliminado.
11. Análise de imagens tridimensionais
Usando a função de medição do formato da superfície, a imagem tridimensional da superfície da amostra pode ser facilmente feita. Não só isso, mas também vários tipos de análise podem ser realizados, tais como: medição de rugosidade superficial, área, volume, área superficial, circularidade, raio, comprimento de zui, perímetro, centro de gravidade, imagem tomográfica, transformação FFT, linha medição de largura e assim por diante.
O microscópio de varredura confocal a laser pode ser usado não apenas para observar a morfologia celular, mas também para análise quantitativa de componentes bioquímicos em células, estatísticas de densidade óptica e medição de morfologia celular.
