Classificação e funcionamento de microscópios para pesquisa celular
O microscópio é a principal ferramenta para observar as células. De acordo com diferentes fontes de luz, pode ser dividido em duas categorias: microscópios ópticos e microscópios eletrônicos. O primeiro usa luz visível (os microscópios UV usam luz ultravioleta) como fonte de luz, enquanto o último usa feixes de elétrons como fonte de luz.
-,Microscópio óptico
(1) Microscópio óptico comum
Os microscópios biológicos comuns são compostos de três partes, a saber: ① sistema de iluminação, incluindo fonte de luz e condensador; ② sistema de ampliação óptica, composto de lente objetiva e ocular, que é o corpo principal do microscópio. A fim de eliminar a aberração esférica e a aberração cromática, tanto a ocular quanto a objetiva ③Dispositivo mecânico, usado para fixar o material e facilitar a observação (Figura 2-1).
Se a imagem do microscópio é clara não é determinada apenas pela ampliação, mas também relacionada à resolução do microscópio. A resolução refere-se à capacidade do microscópio (ou do olho humano estar a 25 cm de distância do alvo) de distinguir a menor distância entre os objetos. O tamanho da resolução é determinado por O comprimento de onda e a relação de abertura da luz e o índice de refração do meio são expressos pela fórmula:
Na fórmula: n=índice de refração do meio;=ângulo de abertura (o ângulo de abertura da amostra para a abertura da lente objetiva), NA=abertura da lente (abertura numérica). O ângulo da lente é sempre menor que 180 graus, então o valor máximo de sina/2 deve ser menor que 1.
O índice de refração do vidro usado para fazer a lente óptica é de 1,65 a 1,78, e o índice de refração do meio usado quanto mais próximo do vidro, melhor. Para lentes objetivas secas, o meio é o ar e a taxa de abertura da lente geralmente é 0.05 a 0,95; para lentes de óleo, o óleo de cedro é usado como meio e a taxa de abertura da lente pode ser próxima de 1,5.
O comprimento de onda da luz comum é {{0}}nm, então o valor de resolução do microscópio não será menor que 0.2μm, e a resolução do olho humano é 0,2mm, então o a ampliação máxima do projeto geral do microscópio é geralmente 1000X.
(2) Microscopia de fluorescência
Algumas substâncias nas células, como a clorofila, podem fluorescer após serem irradiadas por raios ultravioleta; algumas substâncias não podem fluorescer, mas se forem coradas com corantes fluorescentes ou anticorpos fluorescentes, elas também podem fluorescer quando irradiadas por raios ultravioleta, e o microscópio de fluorescência (Fig. 2-2, 3, 4) é uma das ferramentas para pesquisas qualitativas e quantitativas sobre tais substâncias.
Microscópios de fluorescência e microscópios comuns têm as seguintes diferenças:
1. O método de iluminação geralmente é a epi-iluminação, ou seja, a fonte de luz é projetada na amostra através da lente objetiva (Figura 2-3);
2. A fonte de luz é a luz ultravioleta, o comprimento de onda é mais curto e a resolução é maior do que a dos microscópios comuns;
3. Existem dois filtros especiais, aquele na frente da fonte de luz é usado para filtrar a luz visível, e aquele entre a ocular e a lente objetiva é usado para filtrar a luz ultravioleta para proteger os olhos.
(3) Microscópio confocal de varredura a laser
O microscópio de varredura confocal a laser (microscópio de varredura confocal a laser, Figura 2-5, 6) usa o laser como fonte de luz de varredura e varre a imagem ponto a ponto, linha por linha, superfície por superfície, e o laser de varredura e a coleção de fluorescência compartilham uma lente objetiva, e o foco da lente objetiva é O ponto focal do laser de varredura também é o ponto objeto da imagem instantânea. Como o comprimento de onda do feixe de laser é curto e o feixe é muito fino, o microscópio confocal de varredura a laser tem uma resolução mais alta, que é cerca de 3 vezes maior que a de um microscópio óptico comum. O sistema é focado uma vez e a varredura é limitada a um plano da amostra. Quando a profundidade de focagem é diferente, podem ser obtidas imagens de diferentes níveis de profundidade da amostra. Essas informações da imagem são armazenadas no computador. Por meio de análise e simulação de computador, a estrutura tridimensional da amostra de célula pode ser exibida.
A microscopia confocal de varredura a laser pode ser usada não apenas para observar a morfologia celular, mas também para análise quantitativa de componentes bioquímicos intracelulares, estatísticas de densidade óptica e medição da morfologia celular.
(4) Microscópio de campo escuro
O microscópio de campo escuro (microscópio de campo escuro, Figura 2-7) tem uma folha de luz no centro do condensador, de modo que a luz de iluminação não entra diretamente na lente humana, e apenas a luz é refletida e difratada pela amostra é permitido entrar na lente objetiva, então o fundo do campo de visão é preto, as bordas dos objetos são brilhantes. Usando este microscópio, partículas tão pequenas quanto 4-200nm podem ser vistas e a resolução pode ser 50 vezes maior do que a dos microscópios comuns.
(5) Microscópio de contraste de fase
O microscópio de contraste de fase (microscópio de contraste de fase, Figura 2-8, 9) de P. Zernike foi inventado em 1932 e ganhou o Prêmio Nobel de Física em 1953 por isso. A maior característica deste microscópio é que ele pode observar espécimes não corados e células vivas.
O princípio básico da microscopia de contraste de fase é alterar a diferença do caminho óptico da luz visível que passa através do espécime para uma diferença de amplitude, melhorando assim o contraste entre várias estruturas e tornando várias estruturas claramente visíveis. Depois de passar pela amostra, a luz é refratada, desviada do caminho óptico original e atrasada em 1/4λ (comprimento de onda). Reforce, aumente ou diminua a amplitude, aumente o contraste. Em termos de estrutura, os microscópios de contraste de fase têm duas características especiais que são diferentes dos microscópios ópticos comuns:
1. O diafragma anular está localizado entre a fonte de luz e o condensador, e sua função é fazer com que a luz que passa pelo condensador forme um cone de luz oco e se concentre na amostra.
2. A placa de fase (placa de fase anular) adiciona uma placa de fase revestida com fluoreto de magnésio na lente objetiva, que pode atrasar a fase de luz direta ou luz difratada em 1/4λ. Existem dois tipos:
①A mais placa de fase: A luz direta é atrasada em 1/4λ. Depois que os dois grupos de ondas de luz são combinados, as ondas de luz são somadas e a amplitude é aumentada. A estrutura da amostra é mais brilhante que o meio circundante, formando um contraste brilhante (ou contraste negativo).
② B mais placa de fase: A luz difratada é atrasada em 1/4λ. Depois que os dois conjuntos de raios são combinados, as ondas de luz são subtraídas e a amplitude torna-se menor, formando um contraste escuro (ou contraste positivo), e a estrutura é mais escura que o meio circundante.
