Aplicação de Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total de Fluorescência
TIRFM (Microscópio de fluorescência de reflexão interna total), microscópio de fluorescência de reflexão interna total, quando a luz entra em um meio com um índice de refração mais baixo de um meio com um índice de refração alto, se o ângulo de incidência for grande o suficiente, toda a luz é refletida sem refração, mas em A interface dos dois meios produz ondas evanescentes que podem excitar a fluorescência dentro de 100 nm perto da interface para realizar a observação da superfície do objeto. A luz de excitação pode ser enviada através do iluminador de um microscópio de fluorescência convencional ou de um iluminador especial, e o ângulo de incidência do laser pode ser controlado. O método de excitação de campo instantâneo é usado para evitar que a luz de excitação entre no detector. A luz de excitação na interface entre o vidro e a água produz um interno completo implementado por reflexão. Devido à atenuação exponencial da luz de excitação, apenas a área da amostra muito próxima da superfície de reflexão total produzirá reflexão de fluorescência, o que reduz muito a interferência do ruído da luz de fundo no alvo de observação, portanto, essa tecnologia é amplamente utilizada na observação dinâmica de substâncias da superfície celular.
Diagrama esquemático de microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM)
①Amostra ②Faixa de onda evanescente ③Cobertura de vidro ④Imersão em óleo ⑤Alvo ⑥ Feixe de emissão (sinal) ⑦ Feixe de excitação
Para atingir a reflexão interna total, é necessário um grande ângulo de incidência, por exemplo, o ângulo de incidência na interface vidro-água é maior que 61 graus. Isso pode ser obtido por um prisma, chamado TIRFM baseado em prisma, ou por uma lente objetiva com alta abertura numérica, chamada TIRFM do tipo objetiva. Os atuais microscópios de fluorescência de reflexão interna total comercializados são geralmente do tipo lente objetiva, com alta velocidade e alta precisão.
A microscopia de fluorescência de reflexão interna total é amplamente utilizada em alguns campos biológicos porque pode realizar a observação da fluorescência em uma faixa muito fina (menos de 100 nm) na superfície dos objetos. Como as seguintes aplicações:
Observação de imagens da superfície celular: estrutura da superfície da membrana celular, contato da superfície celular, dinâmica da superfície da membrana/localização de proteínas.
Observação e manipulação de moléculas únicas: miosina, actina e ATP marcado com Cy3-.
Movimento da superfície da membrana celular: como engolfamento de vesículas, exalação de vesículas e vesícula exócrina. o
Observação do fenômeno de faísca de cálcio na membrana celular, monitoramento de canais iônicos.
Pesquisa motora molecular: motores rotacionais, proteínas do citoesqueleto, polímeros, proteínas G, proteínas em anel, motores de nucleotídeos.
Além do campo da biologia, também possui boas aplicações no campo da química para a observação de estruturas moleculares químicas.
