Um conhecimento prático de microscopia confocal de fluorescência
O princípio básico da microscopia confocal de fluorescência: Use uma fonte de luz pontual para iluminar a amostra e formar um ponto de luz pequeno e bem definido no plano focal. A fluorescência emitida pelo spot após ser iluminado é coletada pela lente objetiva e devolvida ao espelho dicróico ao longo do caminho de luz de iluminação original. constituem um divisor de feixe. O espectrômetro envia a fluorescência diretamente para o detector. Há um orifício na frente da fonte de luz e do detector, que são chamados de orifício de iluminação e orifício de detecção, respectivamente. As dimensões geométricas dos dois são consistentes, cerca de 100-200nm; em relação ao ponto de luz no plano focal, os dois são conjugados, ou seja, o ponto de luz passa por uma série de lentes e pode, em última análise, ser focado no orifício de iluminação e no orifício de detecção ao mesmo tempo. Desta forma, a luz do plano focal pode ser concentrada dentro do alcance do orifício de detecção, enquanto a luz espalhada acima ou abaixo do plano focal é bloqueada fora do orifício de detecção e não pode ser visualizada. A amostra é escaneada ponto a ponto com o laser, e o tubo fotomultiplicador atrás do orifício de detecção também obtém a imagem confocal do ponto de luz correspondente ponto a ponto, que é convertida em um sinal digital e transmitida ao computador, e finalmente agregada em a tela em uma imagem confocal clara de todo o plano focal. .
Cada imagem do plano focal é na verdade uma seção transversal óptica da amostra. Esta seção transversal óptica sempre tem uma certa espessura e também é chamada de seção delgada óptica. Como a intensidade da luz no foco é muito maior que a intensidade da luz no não foco, e a luz do plano não focal é filtrada pelo pinhole, a profundidade de campo do sistema confocal é aproximadamente zero. A varredura ao longo da direção do eixo Z pode realizar a tomografia óptica, formando a observação desejada da seção óptica bidimensional no ponto focado da amostra. Combinando a varredura do plano XY (plano focal) com a varredura do eixo Z (eixo óptico), acumulando níveis contínuos de imagens bidimensionais e processando-as com software de computador especializado, uma imagem tridimensional da amostra pode ser obtida.
Ou seja, o orifício de detecção e o orifício da fonte de luz estão sempre focados no mesmo ponto, de modo que a fluorescência excitada fora do plano de foco não pode entrar no orifício de detecção.
A expressão simples do princípio de funcionamento do laser confocal é que ele usa o laser como fonte de luz. Com base na imagem tradicional do microscópio de fluorescência, são adicionados um dispositivo de varredura a laser e um dispositivo de foco conjugado, e o sistema é controlado por um computador para coletar e processar imagens digitais.
