Uma Comparação de Diferentes Técnicas para Microscopia de Super-Resolução
Para a microscopia de luz convencional, a difração da luz limita a resolução da imagem a aproximadamente 250 nm. Hoje, as técnicas de super-resolução podem melhorar isso em mais de um fator de 10. Essa técnica é obtida principalmente por meio de três métodos: microscopia de localização de molécula única, incluindo microscopia de localização fotossensível (PALM) e microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM); microscopia de iluminação estruturada (SIM); e microscopia de depleção por emissão estimulada (STED). Como escolher a tecnologia de super-resolução é o que interessa a todos. "Infelizmente, não existem princípios simples para decidir qual método usar", diz Mathew Stracy, pesquisador de pós-doutorado na Universidade de Oxford, no Reino Unido. "Cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens." É claro que os cientistas também estão descobrindo como escolher o método certo para um projeto específico. "No contexto da bioimagem, os principais fatores a serem considerados incluem: resolução espacial e temporal, sensibilidade ao fotodano, capacidade de rotulagem, espessura da amostra e fluorescência de fundo ou fluorescência autóloga celular." Como funciona Os vários microscópios de super-resolução funcionam de maneiras diferentes. No caso do PALM e STORM, apenas uma pequena fração dos marcadores fluorescentes é excitada ou fotoativada em um determinado momento, permitindo sua localização independente com alta precisão. Passar por esse processo com todas as etiquetas fluorescentes resulta em uma imagem completa de super-resolução. Stefan Hell, um dos vencedores do Prêmio Nobel de Química de 2014 e diretor do Instituto Max Planck de Química Biofísica, disse: "O sistema PALM/STORM é relativamente fácil de configurar, mas é difícil de aplicar, porque o fluorescente grupo deve ter capacidade de fotoativação. Limitações A desvantagem é que eles precisam detectar uma única molécula fluorescente no contexto de uma célula e são menos confiáveis do que STED." O STED usa um pulso de laser para excitar o fluoróforo e um laser em forma de anel para extinguir o fluoróforo, deixando apenas a fluorescência intermediária de tamanho nanométrico para super-resolução. A varredura de toda a amostra produz uma imagem. "A vantagem do STED é que é uma tecnologia de botão", explicou Hell. "Funciona como um microscópio de fluorescência confocal padrão." Ele também pode gerar imagens de células vivas usando fluoróforos, como proteínas fluorescentes verdes ou amarelas e corantes derivados de rodamina. Comparação paramétrica Embora todas as técnicas de super-resolução superem a microscopia de luz convencional em termos de resolução, elas diferem umas das outras. O SIM praticamente dobra a resolução para cerca de 100 nm. PALM e STORM podem resolver alvos de 15 nm. De acordo com Hell, o STED fornece uma resolução espacial de 30 nm em células vivas e 15 nm em células fixas. Quando se trata de aplicações específicas, devemos considerar também a relação sinal-ruído. Em alguns casos, resolução mais baixa, mas SNR mais alto, pode resultar em uma imagem melhor do que o oposto (resolução mais alta, mas SNR mais baixo). A velocidade de aquisição da imagem também é muito importante, especialmente para células vivas. "Todas as técnicas de super-resolução são mais lentas do que as técnicas convencionais de imagem de fluorescência", disse Stracy. "O PALM/STORM é o mais lento, precisa de dezenas de milhares de quadros para obter uma única imagem, o SIM precisa de dezenas de quadros e o STED é uma tecnologia de escaneamento, então a velocidade de aquisição depende do tamanho do campo de visão." Além das células vivas ou células fixas de imagem, alguns cientistas também querem entender como os objetos se movem. Stracy está interessado em entender a dinâmica dos sistemas biológicos em células vivas, não apenas em imagens estáticas. Ele combina o PALM com rastreamento de partícula única para analisar a dinâmica em células vivas. Dessa forma, ele pode rastrear diretamente as moléculas marcadoras conforme elas executam suas funções. No entanto, ele acredita que o SIM não é adequado para estudar esses processos dinâmicos no nível molecular, mas devido à sua rápida velocidade de aquisição, é particularmente adequado para observar a dinâmica de estruturas maiores, como cromossomos inteiros. Os últimos resultados Em 2017, a equipe de Hell relatou o microscópio de super-resolução MINFLUX na Science. De acordo com Hell, este método de super-resolução atinge uma resolução espacial de 1 nm pela primeira vez. Além disso, pode rastrear moléculas individuais em células vivas pelo menos 100 vezes mais rápido do que outros métodos. Outros cientistas também elogiaram o microscópio MINFLUX. "Novas aplicações e abordagens estão sendo constantemente desenvolvidas, mas dois avanços se destacam para mim", disse Shechtman. Um deles é o MINFLUX. "Ele usa uma abordagem engenhosa para obter um posicionamento molecular muito preciso." Em relação ao segundo desenvolvimento emocionante, Shechtman mencionou WE Moerner e seus colegas da Universidade de Stanford. Moerner também recebeu o Prêmio Nobel de Química de 2014. Um dos vencedores. Para resolver a limitação da resolução da imagem causada pela dispersão anisotrópica de moléculas fluorescentes individuais, os cientistas usaram diferentes polarizações de excitação para determinar a orientação e a posição das moléculas. Além disso, desenvolveram delicadas superfícies pupilares. Essas técnicas melhoram a capacidade de localizar estruturas. Sobre etiquetas fluorescentes Em muitas aplicações de super-resolução, as etiquetas realmente importam. Existem também algumas empresas que fornecem produtos relacionados. Por exemplo, a Miltenyi da Alemanha se uniu à Abberior, uma empresa fundada por Stefan Hell, para fornecer serviços personalizados de conjugação de anticorpos para corantes de microscopia de super-resolução. Várias outras empresas também oferecem marcadores correspondentes. "Nossos Nano-Boosters são muito pequenos, apenas 1,5 kDa e altamente específicos", diz Christoph Eckert, diretor de marketing da ChromoTek. Essas proteínas se ligam às proteínas fluorescentes verdes e vermelhas (GFP e RFP). Eles são derivados de fragmentos de anticorpos de alpaca, conhecidos como VHH ou nanocorpos, com excelentes propriedades de ligação e qualidade estável sem variação de lote para lote. Esses marcadores são adequados para várias técnicas de super-resolução, incluindo SIM, PALM, STORM e STED. Ai-Hui Tang, professor assistente da Escola de Medicina da Universidade de Maryland, e seus colegas usaram o GFP-Booster e o STORM da ChromoTek para explorar a propagação de informações no sistema nervoso. Eles encontraram nanoclusters moleculares, chamados nanocolunas, em neurônios pré-sinápticos e pós-sinápticos. Os cientistas acreditam que essa estrutura mostra que o sistema nervoso central emprega princípios simples para manter e regular a eficiência sináptica. Várias versões de imagens de super-resolução e um número crescente de métodos estão levando os cientistas ainda mais fundo nos mistérios biológicos. Ao quebrar o limite de difração da luz visível, os biólogos podem até “monitorar de perto” as ações das células.
