Contagem direta com um microscópio para micróbios
princípio experimental
A contagem direta sob um microscópio usando um hemocitômetro é um método de contagem microbiana comumente usado. A vantagem desse método é que ele é intuitivo e rápido. Coloque a suspensão bacteriana adequadamente diluída (ou suspensão de esporos) na câmara de contagem entre a lâmina e a tampa de vidro do hemocitômetro e conte ao microscópio. Como o volume da câmara de contagem é fixo (0.1mm2), ele pode ser convertido no número total de microorganismos por unidade de volume de acordo com o número de microorganismos observados no microscópio. Como esse método conta a soma de bactérias vivas e mortas, também é chamado de método de contagem total de bactérias.
Um hemocitômetro é geralmente uma lâmina de vidro especial na qual quatro ranhuras formam três plataformas. A plataforma no meio é dividida em duas metades por um pequeno sulco horizontal. Uma grade é gravada na plataforma de cada lado. Cada grade é dividida em nove grandes quadrados. O grande quadrado no meio é a sala de contagem. Os microrganismos são contados na câmara de contagem. A estrutura da placa de contagem de células sanguíneas é mostrada na Figura Ⅷ-1.
A escala da sala de contagem geralmente tem duas especificações, uma é que um quadrado grande é dividido em 16 quadrados do meio e cada quadrado do meio é dividido em 25 quadrados pequenos (Figura Ⅷ-2); o outro é um quadrado grande. O quadrado é dividido em 25 quadrados do meio, e cada quadrado do meio é dividido em 16 quadrados pequenos (Figura Ⅷ-1, C). Mas não importa que tipo de tabuleiro de contagem seja, o número de pequenos quadrados em cada quadrado grande é o mesmo, ou seja, 16×25=400 quadrados pequenos, conforme mostrado na Figura Ⅷ-2.
O comprimento do lado de cada quadrado grande é de 1 mm e a área de cada quadrado grande é de 1 mm2. Depois que a tampa de vidro é coberta, a altura entre a lâmina de vidro e a tampa de vidro é 0,1 mm, então o volume da câmara de contagem é 0,1mm3.
Ao contar, geralmente conte o número total de bactérias nos cinco quadrados do meio, obtenha o valor médio de cada quadrado do meio e multiplique por 16 ou 25 para obter o número total de bactérias em um quadrado grande e, em seguida, converta para o número total de bactérias em 1ml de solução bacteriana.
Equipamento de laboratório
Hemocitômetro, microscópio, lamínula, capilar estéril;
Materiais Experimentais
Saccharomyces cerevisiae suspensão
Procedimento experimental (método de contagem direta do microscópio microbiano)
1. diluição
Dilua adequadamente a suspensão de Saccharomyces cerevisiae. Se a solução bacteriana não for espessa, não precisa ser diluída.
2. Sala de contagem microscópica
Antes de adicionar amostras, faça uma inspeção microscópica da câmara de contagem do prato de contagem. Se houver sujeira, ela precisa ser limpa antes de contar.
3. adicione amostra
Cubra a placa do hemocitômetro limpa e seca com uma lamela e, em seguida, use um conta-gotas estéril de boca fina para deixar cair uma pequena gota da solução diluída de Saccharomyces cerevisiae da borda da lamínula (não muito), para que a solução de bactérias está perto da lacuna ao longo da lacuna. A osmose capilar entra na câmara de contagem por si só, e a câmara de contagem geral pode ser preenchida com líquido bacteriano. Cuidado para não formar bolhas de ar.
4. contagem de microscópio
Depois de descansar por 5 minutos, coloque o hemocitômetro no palco do microscópio, primeiro use uma lente de baixa potência para encontrar a localização da câmara de contagem e, em seguida, mude para uma lente de alta potência para contagem. Se for constatado que a solução bacteriana é muito espessa ou muito fina antes da contagem, é necessário reajustar a diluição antes da contagem. Geralmente, a diluição da amostra requer cerca de 5-10 bactérias em cada célula. Cada câmara de contagem seleciona as bactérias em 5 grades intermediárias (4 cantos opcionais e grades centrais) para contagem. As bactérias na linha da grade geralmente são contadas apenas nas linhas superior e direita. No caso de brotamento de levedura, quando o tamanho do corpo do broto atingir metade da célula-mãe, conte duas bactérias. Conte uma amostra para calcular o conteúdo bacteriano da amostra a partir dos valores contados nas duas câmaras de contagem.
5. Limpeza do hemocitômetro
Após o uso, enxágue a placa de contagem de glóbulos na torneira com jatos de água, não a lave com objetos duros e seque-a sozinho ou com secador de cabelo após a lavagem. Ao exame microscópico, observe se há bactérias residuais ou outros sedimentos em cada célula. Se não estiver limpo, deve ser lavado várias vezes até ficar limpo.
