Estrutura básica da microscopia confocal de fluorescência
(1) Módulo de digitalização
O módulo de varredura consiste principalmente em uma barra de luz pinhole (controlando a espessura das fatias ópticas), um espectroscópio (mudando a direção da propagação da luz de acordo com o comprimento de onda), um colorímetro de fluorescência de emissão (selecionando luz dentro de uma determinada faixa de comprimento de onda para detecção) e um detector (tubo fotomultiplicador). A fluorescência mista na amostra fluorescente entra no scanner e, após ser selecionada pela barra de luz pinhole de detecção, espectrômetro e colorímetro, é dividida em várias fluorescências monocromáticas, que são detectadas em diferentes canais de fluorescência e formam imagens confocal correspondentes. Ao mesmo tempo, várias imagens de fluorescência monocromáticas paralelas e suas imagens compostas podem ser exibidas na tela do computador.
(2) Sistema de microscopia de fluorescência
O microscópio é o principal componente do LSCM, que está relacionado à qualidade da imagem do sistema. O caminho óptico do microscópio pode ser facilmente inserido em um sistema óptico infinitamente distante com opções ópticas sem afetar a qualidade da imagem e a precisão da medição. A objetiva deve ser uma objetiva apocromática de campo plano de grande abertura numérica, que é benéfica para aquisição de fluorescência e imagens nítidas. A conversão do grupo de lentes objetivas, a seleção do grupo de filtros de cores, o ajuste do movimento da platina e o bloqueio de memória do plano focal devem ser todos controlados automaticamente pelo computador.
O microscópio de fluorescência utilizado na microscopia confocal de varredura a laser é geralmente igual ao microscópio de fluorescência convencional, mas possui características próprias: precisa ser conectado a um scanner, para que o laser possa entrar na objetiva do microscópio para irradiar a amostra e fazer a fluorescência emitida pela amostra chega ao detector; É necessário um dispositivo de conversão de caminho óptico, que converte lâmpadas de mercúrio em lasers, e a intensidade da luz da lâmpada de mercúrio pode ser ajustada.
(3) Lasers comuns
As fontes de laser usadas na microscopia confocal de varredura a laser incluem sistemas de laser único e multilaser, e os lasers comumente usados incluem os três tipos a seguir:
Laser semicondutor: 405 nm (próximo à linha espectral ultravioleta)
Laser de íon de argônio: 457nm, 477nm, 488nm, 514nm (luz azul verde)
Laser He-Ne: 543 nm (laser verde He-Ne de luz verde) 633 nm (laser vermelho He-Ne de luz vermelha)
Laser UV (laser UV): 351 nm, 364 nm (luz UV)
(4) Equipamento auxiliar
Sistemas de refrigeração refrigerados a ar e a água e fontes de alimentação reguladas.
O princípio básico de funcionamento de um microscópio confocal de varredura a laser é primeiro emitir um certo comprimento de onda de luz de excitação do laser. Após a amplificação, a luz passa através da barra de luz iluminada no scanner para formar uma fonte de luz pontual. A lente objetiva foca no plano focal da amostra, e os pontos iluminados correspondentes na amostra são excitados e emitem fluorescência. Depois de passar pela barra de luz do orifício de detecção, ela atinge o detector e é visualizada na tela de monitoramento do computador. Desta forma, uma imagem confocal completa é formada pelas imagens de fluorescência de cada ponto da amostra no plano focal, que é chamada de fatia de luz.
