Por que preciso usar um microscópio confocal?
1. O microscópio óptico foi aperfeiçoado através dos esforços e melhorias de nossos grandes antecessores. Na verdade, o microscópio comum pode nos fornecer belas imagens microscópicas com facilidade e rapidez. No entanto, o evento que revolucionou o mundo dos microscópios quase perfeitos foi a invenção do "microscópio confocal de varredura a laser". Este novo tipo de microscópio caracteriza-se por um sistema óptico que extrai a informação da imagem apenas da superfície onde o foco está concentrado, e alterando o foco enquanto recupera a informação adquirida na memória da imagem, é possível obter uma imagem nítida com informações dimensionais 3-completas. Desta forma, é possível obter facilmente informações sobre o formato da superfície que não podem ser confirmadas com um microscópio convencional. Além disso, embora "aumentar a resolução" e "aprofundar a profundidade de foco" sejam condições conflitantes para microscópios ópticos convencionais, especialmente em grandes ampliações, esse problema é resolvido com microscópios confocal.
2. Vantagens do sistema óptico confocal
Diagrama esquemático do microscópio confocal a laser
O sistema óptico confocal é uma iluminação pontual da amostra, enquanto a luz refletida também é recebida por meio de um receptor pontual. Quando a amostra é colocada no ponto focal, quase toda a luz refletida atinge o fotorreceptor e, quando a amostra está fora de foco, a luz refletida não consegue atingir o fotorreceptor. Em outras palavras, em um sistema óptico confocal, apenas a imagem que coincide com o ponto focal é emitida, e os pontos e a luz dispersa inútil são bloqueados.
3. Por que usar um laser?
Em um sistema óptico confocal, a amostra é iluminada em um ponto e a luz refletida é recebida por um sensor pontual. Portanto, uma fonte de luz pontual é necessária. Os lasers são basicamente uma fonte de luz pontual. Na maioria dos casos, a fonte de luz para microscópios confocal é uma fonte de luz laser. Além disso, a monocromaticidade, a direcionalidade e o excelente formato do feixe dos lasers são razões importantes para sua ampla adoção.
4. É possível a observação em tempo real com base na varredura de alta velocidade.
Para varredura a laser, uma unidade de deflexão óptica acústica (Defletor Óptico Acústico, AO prime) é usada na direção horizontal, e um espelho de varredura de feixe controlado servoeletrônico (espelho Servo Galvano) é usado na direção vertical. Como não há vibração mecânica no Defletor AO, a varredura em alta velocidade é possível e a observação em tempo real na tela do monitor é possível. A alta velocidade desta câmera é um item muito importante que afeta diretamente a velocidade de foco e recuperação de posição.
5. Relação entre posição de foco e brilho
Em um sistema óptico confocal, a amostra é colocada corretamente na posição focal quando o brilho é grande, na frente e atrás dela, seu brilho será drasticamente reduzido (Figura 4 linha sólida). Esta seletividade sensível do plano focal é o princípio por trás da orientação de altura do microscópio confocal e da expansão da profundidade do foco. Em contraste, os microscópios ópticos usuais não mostram qualquer alteração significativa no brilho antes e depois da posição focal (linha pontilhada na Fig. 4).
6. Alto contraste, alta resolução
Em um microscópio óptico convencional, a luz refletida da porção fora de foco do microscópio interfere e se sobrepõe à porção de imagem focal do microscópio, resultando em uma diminuição no contraste da imagem. Em contraste, num sistema óptico confocal, a luz espalhada fora do ponto focal e dentro da lente objectiva é quase completamente removida, resultando em imagens com contraste muito elevado. Além disso, o poder de resolução do microscópio é melhorado porque a luz passa duas vezes pela lente objetiva, tornando a imagem pontual mais nítida.
7. Função de localização óptica
No sistema óptico confocal, a luz refletida é protegida pela microabertura em um ponto diferente do ponto focal. Como resultado, ao observar uma amostra tridimensional, a imagem é formada como se a amostra tivesse sido fatiada com o ponto focal (Fig. 5). Este efeito é chamado de localização óptica e é uma das características dos sistemas ópticos confocal.
