A microscopia de fluorescência de dois fótons tem muitas vantagens:
1) Comprimentos de onda de luz mais longos são menos afetados pela dispersão do que comprimentos de onda de luz mais curtos para penetrar na amostra;
(2) Moléculas fluorescentes fora do plano focal não são excitadas para que mais luz de excitação possa atingir o plano focal, de modo que a luz de excitação possa penetrar mais profundamente na amostra;
3) Comprimentos de onda mais longos da luz infravermelha próxima são menos tóxicos para as células do que comprimentos de onda mais curtos;
4) Ao usar um microscópio de dois fótons para observar uma amostra, o fotobranqueamento e a fototoxicidade estão presentes apenas no plano focal. Portanto, os microscópios de dois fótons são mais adequados do que os microscópios de fóton único para a observação de amostras espessas, para a observação de células vivas ou para a realização de experimentos de fotodegradação pontual.
Conhecimento do microscópio confocal de fluorescência
O princípio básico do microscópio confocal de fluorescência: uma fonte de luz pontual é usada para irradiar a amostra, formando um ponto de luz pequeno e bem definido no plano focal. A fluorescência emitida a partir deste ponto após a irradiação é coletada pela lente objetiva e enviada de volta ao divisor de feixe que consiste em um espelho cromático bidirecional ao longo do caminho original da luz de irradiação. O divisor de feixe envia a fluorescência diretamente para o detector. Tanto a fonte de luz quanto o detector têm, cada um, um orifício na frente deles, denominado orifício de iluminação e orifício de detecção, respectivamente. Ambos têm a mesma geometria, cerca de 100-200 nm, e são conjugados em relação ao ponto de luz no plano focal, ou seja, o ponto de luz passa através de uma série de lentes e pode, em última análise, ser focado tanto no iluminador quanto no plano focal. e furos de detector. Desta forma, a luz do plano focal pode convergir para dentro da abertura da sonda, enquanto a luz dispersa acima ou abaixo do plano focal é bloqueada fora da abertura da sonda e não pode ser visualizada. O laser varre a amostra ponto por ponto, e o tubo fotomultiplicador após detectar o pinhole também obtém a imagem confocal da luz correspondente ponto por ponto, que é convertida em um sinal digital e transmitida ao computador, e finalmente converge em um claro imagem confocal de todo o plano focal na tela.
Cada imagem do plano focal é na verdade uma seção transversal óptica da amostra, e essa seção transversal óptica sempre tem uma certa espessura, também conhecida como folha óptica. Como a intensidade da luz no ponto focal é muito maior do que no ponto não focal, e a luz do plano não focal é filtrada pelo orifício, a profundidade de campo do sistema confocal é aproximada a zero, e a varredura ao longo da direção do eixo Z permite que a tomografia óptica forme uma fatia óptica bidimensional da amostra a ser observada no ponto focal. Combinando a varredura do plano XY (plano focal) com a varredura do eixo Z (eixo óptico), uma imagem tridimensional da amostra pode ser obtida acumulando camadas sucessivas de imagens bidimensionais, que são processadas por software de computador especializado.
Isso significa que o orifício de detecção e o orifício da fonte de luz estão sempre focados no mesmo ponto, de modo que a fluorescência excitada fora do plano focal não pode entrar no orifício de detecção.
O princípio de funcionamento do laser confocal é expresso simplesmente que ele usa o laser como fonte de luz, com base na imagem tradicional do microscópio de fluorescência, dispositivo adicional de varredura a laser e dispositivo de foco conjugado, através do controle do computador para realizar o sistema de aquisição e processamento de imagens digitais.
