Há muitas vantagens na microscopia de fluorescência de dois fótons
1) A luz de comprimento de onda longo é menos afetada pela dispersão do que a luz de comprimento de onda curto e pode penetrar facilmente na amostra;
2) Moléculas fluorescentes fora do plano focal não são excitadas, permitindo que mais luz de excitação alcance o plano focal, permitindo que a luz de excitação penetre em amostras mais profundas;
3) A luz infravermelha próxima de comprimento de onda longo é menos tóxica para as células do que a luz de comprimento de onda curto;
4) Ao observar amostras usando um microscópio de dois fótons, o fotobranqueamento e a fototoxicidade ocorrem apenas no plano focal. Portanto, os microscópios de dois fótons são mais adequados do que os microscópios de fóton único para observar amostras espessas, para observar células vivas ou para realizar experimentos de fotodegradação de ponto fixo.
Conhecimento sobre microscopia confocal de fluorescência
O princípio básico da microscopia confocal de fluorescência: Use uma fonte de luz pontual para iluminar a amostra e formar um ponto de luz pequeno e bem definido no plano focal. A fluorescência emitida pelo spot após ser iluminado é coletada pela lente objetiva e devolvida ao espelho dicróico ao longo do caminho de luz de iluminação original. constituem um divisor de feixe. O espectrômetro envia a fluorescência diretamente para o detector. Há um orifício na frente da fonte de luz e do detector, que são chamados de orifício de iluminação e orifício de detecção, respectivamente. As dimensões geométricas dos dois são consistentes, cerca de 100-200nm; em relação ao ponto de luz no plano focal, os dois são conjugados, ou seja, o ponto de luz passa por uma série de lentes e pode, em última análise, ser focado no orifício de iluminação e no orifício de detecção ao mesmo tempo. Desta forma, a luz do plano focal pode ser concentrada dentro do orifício de detecção, enquanto a luz espalhada acima ou abaixo do plano focal é bloqueada fora do orifício de detecção e não pode ser visualizada. A amostra é escaneada ponto a ponto com o laser, e o tubo fotomultiplicador atrás do orifício de detecção também obtém a imagem confocal da luz correspondente ponto a ponto, que é convertida em um sinal digital e transmitida ao computador, e é finalmente agregada na tela em uma imagem confocal clara de todo o plano focal. .
Cada imagem do plano focal é na verdade uma seção transversal óptica da amostra. Esta seção transversal óptica sempre tem uma certa espessura e também é chamada de seção delgada óptica. Como a intensidade da luz no foco é muito maior que a intensidade da luz no não foco, e a luz do plano não focal é filtrada pelo pinhole, a profundidade de campo do sistema confocal é aproximadamente zero. A varredura ao longo da direção do eixo Z pode realizar a tomografia óptica, formando a observação desejada da seção óptica bidimensional no ponto focado da amostra. Combinando a varredura do plano XY (plano focal) com a varredura do eixo Z (eixo óptico), acumulando níveis contínuos de imagens bidimensionais e processando-as com software de computador especializado, uma imagem tridimensional da amostra pode ser obtida.
Ou seja, o orifício de detecção e o orifício da fonte de luz estão sempre focados no mesmo ponto, de modo que a fluorescência excitada fora do plano de foco não pode entrar no orifício de detecção.
A expressão simples do princípio de funcionamento do laser confocal é que ele usa o laser como fonte de luz. Com base na imagem tradicional do microscópio de fluorescência, são adicionados um dispositivo de varredura a laser e um dispositivo de foco conjugado, e o sistema é controlado por um computador para coletar e processar imagens digitais.
