O principal método de observação do microscópio óptico é a observação de fluorescência
A fluorescência refere-se ao processo no qual uma substância fluorescente emite luz com um comprimento de onda mais longo quase simultaneamente quando é irradiada com luz de um comprimento de onda específico (Figura 1). Quando a luz de um comprimento de onda específico (comprimento de onda de excitação) atinge uma molécula, como as de um fluoróforo, a energia do fóton é absorvida pelos elétrons da molécula. Em seguida, os elétrons passam do estado fundamental (S0) para um nível de energia mais alto, o estado excitado (S1'). Este processo é chamado de excitação①. O elétron permanece no estado excitado por 10-9–10-8 segundos, durante os quais o elétron perde um pouco de energia②. Durante o processo de saída dos elétrons do estado excitado (S1) e retorno ao estado fundamental③, a energia restante absorvida durante o processo de excitação é liberada.
O tempo de residência da molécula fluorescente no estado excitado é o tempo de vida da fluorescência, que geralmente está no nível de nanossegundos e é uma característica inerente da própria molécula fluorescente. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), que usa tecnologia de imagem de fluorescência vitalícia, é chamada de imagem de fluorescência vitalícia (FLIM). Além da imagem de intensidade de fluorescência, medições funcionais e precisas mais aprofundadas podem ser obtidas para obter conformação molecular, interações intermoleculares e o microambiente das moléculas. Informações que são difíceis de obter com imagens ópticas convencionais.
Outra propriedade importante da fluorescência é o deslocamento de Stokes, a diferença de comprimento de onda entre os picos de excitação e emissão (Figura 2). Normalmente, o comprimento de onda de emissão é maior que o comprimento de onda de excitação. Isso ocorre porque os elétrons perderão parte de sua energia por meio do processo de relaxamento após a substância fluorescente ser excitada e antes de liberar os fótons. Substâncias fluorescentes com grandes deslocamentos de Stokes são mais fáceis de observar sob um microscópio de fluorescência.
Microscopia de fluorescência e cubos de filtro de fluorescência
O microscópio de fluorescência é um microscópio óptico que usa propriedades de fluorescência para observação e geração de imagens e é amplamente utilizado em vários campos, como biologia celular, neurobiologia, botânica, microbiologia, patologia e genética. A imagem de fluorescência tem as vantagens de alta sensibilidade e alta especificidade e é muito adequada para a observação da distribuição de proteínas e organelas específicas em tecidos e células, o estudo de colocalização e interação, o rastreamento de processos dinâmicos da vida, como mudanças na concentração de íons , etc
A maioria das moléculas nas células não é fluorescente e, para vê-las, elas devem ser marcadas com fluorescência. Existem muitos métodos de marcação fluorescente, como a marcação direta (como o uso de DAPI para rotular o DNA), ou imunocoloração usando as propriedades de ligação ao antígeno dos anticorpos ou o uso de proteínas fluorescentes (como GFP, proteína fluorescente verde) para rotular as proteínas-alvo. , e ligação reversível. Corantes sintéticos (como Fura-2) e assim por diante.
Atualmente, o microscópio de fluorescência tornou-se o equipamento de imagem padrão de vários laboratórios e plataformas de imagem e é um bom auxiliar para nossos experimentos diários. Os microscópios de fluorescência são divididos principalmente em três categorias: microscópios de fluorescência verticais (adequados para fatiar), microscópios de fluorescência invertidos (adequados para células vivas, levando em consideração o corte), estereoscópios fluorescentes (adequados para espécimes maiores, como plantas, peixes-zebra (adultos/embriões ), medaka, órgãos de camundongo/rato, etc.).
O bloco de filtro de fluorescência é o componente central da imagem de fluorescência do microscópio. Consiste em três partes: filtro de excitação, filtro de emissão e divisor de feixe dicróico. É instalado na roda do filtro. Por exemplo, o Leica DMi8 está equipado com uma roda de filtro de posição 6- (Fig. 3 ). O número de posições das diferentes rodas do microscópio será diferente e alguns microscópios usam lâminas de bloco de filtro.
O bloco de filtro desempenha um papel importante na geração de imagens de fluorescência: o filtro de excitação seleciona a luz de excitação para excitar a amostra e bloqueia a luz de outros comprimentos de onda; a luz que passa pelo filtro de excitação passa pelo espelho dicróico (sua função é refletir a luz de excitação e transmitir a fluorescência), após a reflexão é focalizada pela lente objetiva, irradia a amostra e excita a fluorescência correspondente, ou seja , luz emitida. A luz emitida é coletada pela lente objetiva, passa pelo divisor de feixe dicróico e chega ao filtro de emissão. Conforme mostrado na Figura 4: o comprimento de onda de excitação é 450-490nm, o espelho dicróico reflete luz menor que 510nm, transmite luz maior que 510nm e o alcance de recepção da luz emitida é 520-560nm.
