O principal método de observação do microscópio óptico é a observação de fluorescência
fenômeno de fluorescência
A fluorescência refere-se ao processo no qual uma substância fluorescente emite luz com um comprimento de onda maior quase simultaneamente quando irradiada com luz de um comprimento de onda específico (Figura 1). Quando a luz de um comprimento de onda específico (comprimento de onda de excitação) atinge uma molécula (como uma molécula em um fluoróforo), a energia do fóton é absorvida pelos elétrons da molécula. Em seguida, os elétrons passam do estado fundamental (S0) para um nível de energia mais alto, o estado excitado (S1'). Este processo é chamado de excitação①. O elétron permanece no estado excitado por 10-9–10-8 segundos, durante os quais o elétron perde alguma energia ②. No processo de saída do estado excitado (S1) e retorno ao estado fundamental ③, a energia restante absorvida durante o processo de excitação será liberada.
O tempo de residência de uma molécula fluorescente no estado excitado é o tempo de vida da fluorescência, geralmente em nanossegundos, que é uma característica inerente da própria molécula fluorescente. A tecnologia de geração de imagens usando o tempo de vida da fluorescência é chamada de Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), que pode realizar medições funcionais e precisas mais aprofundadas, além de imagens de intensidade de fluorescência para obter conformação molecular, interações intermoleculares e microambientes moleculares. informações que são difíceis de obter com imagens ópticas convencionais.
Outra propriedade importante da fluorescência é o deslocamento de Stokes, a diferença de comprimento de onda entre os picos de excitação e emissão (Figura 2). Normalmente, o comprimento de onda da luz de emissão é maior que o comprimento de onda da luz de excitação. Isso porque depois que a substância fluorescente é excitada e antes que o fóton seja liberado, os elétrons perdem uma parte da energia pelo processo de relaxamento. Substâncias fluorescentes com grandes deslocamentos de Stokes são mais fáceis de observar sob um microscópio de fluorescência.
Microscópios de fluorescência e blocos de filtro de fluorescência
A microscopia de fluorescência é um microscópio óptico que usa propriedades de fluorescência para observar e criar imagens, e é amplamente utilizado em biologia celular, neurobiologia, botânica, microbiologia, patologia, genética e outros campos. A imagem de fluorescência tem as vantagens de alta sensibilidade e alta especificidade e é muito adequada para a observação da distribuição de proteínas específicas, organelas, etc. em tecidos e células, o estudo da co-localização e interação e o rastreamento da dinâmica da vida processos como mudanças na concentração de íons.
A maioria das moléculas nas células não é fluorescente e, para vê-las, elas devem ser marcadas com fluorescência. Existem muitos métodos de marcação fluorescente, que podem ser marcados diretamente (como o uso de DAPI para rotular o DNA) ou imunocoloração usando as propriedades de ligação ao antígeno dos anticorpos, ou a proteína alvo pode ser marcada com proteínas fluorescentes (como GFP, verde proteína fluorescente) ou ligação reversível. corantes sintéticos (como Fura-2), etc.
Atualmente, o microscópio de fluorescência tornou-se o equipamento de imagem padrão de vários laboratórios e plataformas de imagem, e é um bom auxiliar para nossos experimentos diários. Os microscópios de fluorescência são divididos principalmente em três categorias: microscópios de fluorescência verticais (adequados para seccionamento), microscópios de fluorescência invertidos (adequados para células vivas, levando em consideração as seções), microscópios estereoscópicos fluorescentes (adequados para espécimes maiores, como plantas, peixes-zebra (adultos/ embrião), medaka, órgãos de camundongo/rato, etc.).
O bloco de filtro de fluorescência é o componente principal da geração de imagens de fluorescência em microscópios. Consiste em um filtro de excitação, um filtro de emissão e um divisor de feixe dicróico. Ele é instalado na roda de filtro, como o Leica DMi8 equipado com uma roda de filtro de posição 6-(Figura 3). ). Microscópios diferentes têm posições de roda diferentes e alguns microscópios usam lâminas de filtro.
O bloco de filtro desempenha um papel importante na geração de imagens de fluorescência: o filtro de excitação seleciona a luz de excitação para excitar a amostra e bloqueia outros comprimentos de onda de luz; a luz que passa pelo filtro de excitação passa por um divisor de feixe dicróico (sua função é refletir a luz de excitação e transmitir a fluorescência), após a reflexão, é focada pela lente objetiva, irradiada para a amostra e a fluorescência correspondente é excitada para emitir luz. A luz emitida é coletada pela lente objetiva, passa pelo divisor de feixe dicróico e chega ao filtro de emissão. Conforme mostrado na Figura 4: o comprimento de onda de excitação é 450-490nm, o divisor de feixe dicróico reflete luz menor que 510nm, transmite luz maior que 510nm e a faixa de recepção de luz de emissão é 520-560nm.
Os filtros de fluorescência comumente usados em microscópios de fluorescência podem ser divididos em dois tipos: passagem longa (LP para abreviar) e passagem de banda (BP para abreviar). A passagem de banda geralmente é determinada pelo comprimento de onda central e a largura do intervalo, como 480/40, o que significa que a luz de 460-500nm pode passar. Os filtros longpass, como o 515 LP, passam a luz com comprimentos de onda superiores a 515 nm (Figura 5).
Substâncias fluorescentes têm sua curva característica de excitação (absorção) e curva de emissão, o pico de excitação é o comprimento de onda de excitação ideal (alta eficiência de excitação, que pode reduzir a energia da luz de excitação, proteger células e corantes) e a curva de emissão é o comprimento de onda de fluorescência de emissão variar. Portanto, no experimento, escolheremos o comprimento de onda o mais próximo possível do pico de excitação para excitação, e o alcance de recepção precisa incluir o pico de emissão. Por exemplo, o pico de excitação do Alexa Fluor 488 é de 500 nm e o filtro de excitação de 480/40 pode ser selecionado no microscópio de fluorescência.
Os detalhes dos cubos de filtro podem ser visualizados no software de imagem do microscópio. Compreender os corantes e encontrar o filtro que melhor corresponda à sua amostra é fundamental para a geração de imagens de fluorescência. A informação espectral de corantes fluorescentes e proteínas fluorescentes é geralmente indicada nas instruções e também pode ser encontrada online.
Além dos comprimentos de onda de excitação e emissão de sondas fluorescentes, a seleção de blocos de filtro também precisa considerar se há excitação não específica e se há cor cruzada para amostras marcadas multicoloridas. Além disso, é necessário considerar a fonte de luz fluorescente utilizada. Atualmente, as fontes de luz fluorescente comumente usadas incluem lâmpadas de mercúrio, lâmpadas de iodetos metálicos e fontes de luz LED que se desenvolveram rapidamente nos últimos anos. O espectro de uma fonte de luz fluorescente é contínuo ou descontínuo, e a energia será diferente em diferentes bandas de comprimento de onda. A fonte de luz LED está gradualmente se tornando a principal fonte de luz do microscópio de fluorescência devido à sua banda espectral relativamente estreita, saída de energia mais estável, longa vida útil, proteção mais segura e ambiental e muitas outras vantagens.
Além do bloco de filtro embutido do microscópio, há também uma roda rápida externa (Figura 7). A velocidade de conversão do filtro adjacente à roda rápida externa da Leica é de 27 ms, o que pode realizar experimentos multicoloridos de alta velocidade, como imagens de cálcio com relação FRET e Fura2. (Fig. 8) e outros.
Uma ampla variedade de técnicas de imagem de microscopia de fluorescência
Para atender às diferentes necessidades de imagem de fluorescência, além dos microscópios de fluorescência, várias soluções de imagem de microscopia de fluorescência foram desenvolvidas:
Os sistemas de imagem de alta definição de campo amplo, como o Leica THUNDER Imager, usam a inovadora tecnologia Clearing da Leica para remover eficientemente os sinais de interferência do plano não focal durante a geração de imagens, apresentando imagens nítidas e as vantagens da geração de imagens de alta velocidade;
O microscópio confocal de varredura a laser usa orifícios para eliminar interferência de plano não focal, realiza seccionamento óptico e obtém imagens de alta definição e imagens tridimensionais;
Microscópios e nanomicroscópios de ultra-alta resolução que ultrapassam o limite de difração podem observar estruturas finas menores que 200 nm;
Um sistema de imagem multifóton usando o princípio de excitação multifóton para imagem de tecido espesso e profundo in vivo;
Tecnologia de imagem de folha de luz com alta resolução temporal e espacial, velocidade de imagem rápida, alta resolução, baixa fototoxicidade, especialmente adequada para pesquisa em desenvolvimento e observação dinâmica in vivo;
A imagem vitalícia de fluorescência (FLIM), que não é afetada por fatores como concentração de substância fluorescente, fotobranqueamento, intensidade da luz de excitação, etc., pode realizar medições funcionais e precisas mais aprofundadas;
Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS) e Espectroscopia de Correlação Cruzada de Fluorescência (FCCS), medem o número molecular e o coeficiente de difusão de moléculas fluorescentes, analisando assim concentração molecular, tamanho molecular, viscosidade, movimento molecular, ligação/dissociação molecular e propriedades ópticas moleculares;
A microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF), com resolução extremamente alta no eixo z, é ideal para estudar a estrutura molecular e a dinâmica das superfícies da membrana celular.
