A diferença entre contraste de fase positivo e negativo em um microscópio
Dependendo da configuração e natureza do anel de fase posicionado no plano focal posterior da objetiva, as amostras podem ser observadas em contraste de fase positivo ou negativo. Este tutorial interativo estuda a relação entre surround (S), difração (D) e partículas brilhantes resultantes (ondas P), bem como microscopia de contraste de fase positiva e negativa. Além disso, a geometria da placa de fase e imagens de amostras representativas também são apresentadas.
Quando as pessoas o usam em seu trabalho agora, a maioria dos pesquisadores está na diferença negativa, e agora a diferença positiva não desempenha muito papel no trabalho de pesquisa científica atual.
O tutorial inicializa a imagem de fase com uma amostra selecionada aleatoriamente que aparece na janela Imagem de contraste de fase, e a relação de onda correspondente é mostrada no lado esquerdo da janela de imagem. Para operar o tutorial, use o cursor do mouse para mover a tradução entre o contraste de fase positivo e negativo ou o controle deslizante do modo de contraste de fase de iluminação brilhante. Quando o controle deslizante é transladado, as imagens que aparecem na janela de imagem de contraste de fase mudam como a amostra aparece no modo de imagem atual definido pelo controle deslizante. Além disso, abaixo do gráfico de forma de onda há uma placa de fase que muda de forma para corresponder ao modo de imagem selecionado pelo controle deslizante. Para visualizar uma nova amostra, use o menu suspenso Amostra selecionada para selecionar outra amostra.
Um gráfico da configuração da placa de fase, relações de onda e vetores associados à geração de imagens de contraste de fase positiva e negativa é apresentado na Figura 1. Exemplos de espécimes fotografados por essas técnicas também são mostrados. Em uma configuração óptica de contraste de fase positivo (linha superior da imagem na Figura 1), a frente de onda surround (S) passa pela placa de fase, resultando em uma mudança de fase líquida de avanço de fase de 180 graus, por 1/4 de comprimento de onda ( 1 meio comprimento de onda). As frentes de onda surround avançadas agora são capazes de participar da interferência destrutiva com ondas difratadas (D) no plano intermediário da imagem. Na maioria dos casos, simplesmente avançar a fase relativa da frente de onda circundante não é suficiente para resultar na geração de imagens de alto contraste em microscópios Nikon. Isso ocorre porque a amplitude das ondas circundantes é significativamente maior que a das ondas difratadas e suprime a imagem resultante produzida pela interferência de uma fração do número total de ondas. Para reduzir a frente de onda circundante a um valor mais próximo da amplitude das ondas difratadas (e realizar interferência no plano da imagem), a opacidade no anel de fase da objetiva é obtida pela aplicação de um metal semitransparente (neutro densidade crescente ) Piso de revestimento. As ondas de luz circundantes, que passam quase completamente através do anel de fase por design, sob microscopia de contraste de fase, são significativamente reduzidas em amplitude pela opacidade da placa de fase para um valor na faixa de 10 a 30 por cento da intensidade original.
Como a onda de partícula resultante é produzida pela interferência* das frentes de onda circundantes e difratadas, a amplitude da onda de partícula (P) produzida pela interferência entre as frentes de onda que chegam ao plano da imagem agora é muito menor do que a circundante quando em Sexual revestimento de densidade aplicado. O efeito líquido é converter a diferença de fase relativa introduzida pela passagem da luz que emerge do plano da imagem através da amostra em uma diferença de amplitude (intensidade). Como o olho humano interpretará a diferença de intensidade como um contraste, a amostra agora é visível na ocular do microscópio e também pode ser capturada na membrana com sistemas de câmeras convencionais ou digitalmente, usando dispositivos CCD ou CMOS. Todos os sistemas de contraste de fase positiva avançam seletivamente a fase da frente de onda surround linear (S) em relação à frente de onda esférica difratada (D). As amostras com um índice de refração mais alto do que o meio circundante aparecem mais escuras em um fundo cinza neutro, enquanto aquelas com um índice de refração menor do que o meio de natação aparecem mais brilhantes do que o fundo cinza.
A fim de modificar a separação espacial das frentes de onda difratadas em torno da fase e amplitude em um sistema óptico de contraste de fase, várias configurações de placa de fase foram introduzidas. Como a placa de fase está localizada no plano focal posterior da objetiva ou muito próximo dele (plano de difração), toda a luz que passa pelo microscópio deve passar por esse componente. A parte da placa de fase em seu foco anular condensador é chamada de região conjugada, enquanto a região restante é chamada de região complementar. A região conjugada contém o material responsável por alterar a fase da luz circundante (não difratada) em mais ou menos 90 graus em relação à frente de onda difratada. Em geral, a área do anel conjugado de fase é mais larga (cerca de 25 por cento) do que a área definida pela imagem do anel de condensação para reduzir a quantidade de luz circundante que se propaga para a área complementar.
A maioria das placas de fase disponíveis nos fabricantes de microscópios modernos são aquelas preparadas por deposição a vácuo de filmes dielétricos e metálicos finos em uma placa de vidro ou montadas diretamente na superfície da lente da objetiva do microscópio. O papel do filme dielétrico é fasear a luz, enquanto o filme metálico atenua a intensidade da luz não difratada. Alguns fabricantes usam vários revestimentos antirreflexo combinados com o filme para reduzir a quantidade de brilho e reflexão da luz difusa de volta ao sistema óptico. Se a placa de fase não for formada na superfície de uma lente, geralmente é cimentada entre lentes sucessivas que residem no plano focal próximo à parte traseira da objetiva. A espessura e o índice de refração dos revestimentos dielétrico, metálico e antirreflexo, bem como os do cimento óptico, são cuidadosamente escolhidos para produzir a mudança de fase desejada entre as regiões complementares e conjugadas da placa de fase. Em termos ópticos, uma placa de fase que muda a fase em relação à luz circundante para difratar a luz em 90 graus (positiva ou negativa) é chamada de placa de quarto de onda devido ao efeito da diferença de caminho óptico nela.
Uma visão geral do inverso de fase positiva é mostrada na Figura 1. A placa de contraste de fase positiva (lado esquerdo da Figura 1) impulsiona a onda surround, por 1/4 de comprimento de onda, devido ao anel de erosão na placa de vidro, que pode ser reduzido pela passagem superior na placa de alto índice O caminho físico da onda percorrido. Por causa da interação com a amostra, quando os raios difratados da amostra (D) são retardados, a diferença do caminho óptico entre as ondas circulares e difratadas que emergem da placa de fase é meio comprimento de onda por 1/4 do comprimento de onda. O resultado líquido é uma diferença de caminho óptico de 180-graus entre as ondas circundantes e difratadas, o que resulta em interferência destrutiva para amostras de alto índice de refração entre os planos da imagem. A curva de amplitude para a fase positiva oposta à onda de interferência destrutiva é mostrada no gráfico superior da Figura 1. A onda de partícula (P) resultante tem uma amplitude menor do que a onda envolvente (S), fazendo com que o objeto pareça comparado a uma onda relativamente fundo mais escuro. Abaixo, imagem da alga verde Zygnema mostrada à direita (rotulada DL). O vetor representado pelo progresso do comprimento de onda de 1/4, que é mostrado como uma onda surround girando no sentido anti-horário de 90-graus em contraste de fase positiva, aparece entre a figura e a imagem na Figura 1.
Alternativamente, a ótica do microscópio também pode ser fabricada para produzir uma fase negativa oposta, como mostrado na parte inferior da Figura 1, caso em que as ondas surround (S) são atrasadas (em vez de avançadas) por um quarto de comprimento de onda em relação a a única onda difratada (D). Como resultado, os espécimes com altos índices de refração aparecem mais brilhantes contra um fundo cinza mais escuro (veja a imagem inferior rotulada como BM na Figura 1). Na fase negativa oposta, a placa de fase objetiva contém um anel elevado que retarda a fase (em vez de avançar a fase como a fase positiva oposta), passando um quarto de comprimento de onda em relação à fase da onda difratada como a onda surround de ordem zero. Como as ondas difratadas foram atrasadas em um quarto de comprimento de onda à medida que passam pela amostra, a diferença do caminho óptico entre as ondas circundantes e difratadas é eliminada e a amostra de alto índice de refração interfere construtivamente no plano da imagem. Observe que a onda de partícula (P) resultante é maior em amplitude do que a onda surround (S) em contraste de fase negativa. Também é mostrada uma reversão de fase negativa, onde o vetor de onda de circunavegação passa por uma rotação de 90 graus no sentido horário do diagrama vetorial.
