Características técnicas e habilidades de uso do microscópio de fluorescência de dois fótons
A microscopia de fluorescência de dois fótons é uma nova tecnologia que combina microscopia confocal de varredura a laser e tecnologia de excitação de dois fótons.
O princípio básico da excitação de dois fótons é: no caso de alta densidade de fótons, as moléculas fluorescentes podem absorver dois fótons de comprimento de onda longo ao mesmo tempo e emitir um fóton de comprimento de onda mais curto após um curto período do chamado tempo de vida do estado excitado . ; O efeito é o mesmo que usar um fóton com metade do comprimento de onda longo para excitar uma molécula fluorescente. A excitação de dois fótons requer uma alta densidade de fótons. Para não danificar as células, a microscopia de dois fótons usa lasers pulsados de modo bloqueado de alta energia. O laser emitido por este laser possui alta energia de pico e baixa energia média, sua largura de pulso é de apenas 100 femtossegundos e seu período pode chegar a 80 a 100 megahertz. Ao usar uma lente objetiva de alta abertura numérica para focar os fótons do laser pulsado, a densidade de fótons no ponto focal da lente objetiva é a mais alta e a excitação de dois fótons ocorre apenas no ponto focal da lente objetiva, então o microscópio de dois fótons não precisa de um orifício confocal, o que melhora a eficiência da detecção de fluorescência. É um importante método de pesquisa nas áreas de morfologia, biologia celular molecular, neurociência e farmacologia.
1. O histórico do surgimento da microscopia de dois fótons - duas limitações da microscopia confocal a laser tradicional:
1) Um é o fenômeno da fototoxicidade: porque o orifício confocal deve ser pequeno o suficiente para obter uma imagem de alta resolução, e a pequena abertura bloqueará grande parte da fluorescência emitida pela amostra, incluindo a fluorescência emitida pelo plano focal, o correspondente Sim, a luz de excitação deve ser forte o suficiente para obter uma relação sinal-ruído suficiente; e o laser de alta intensidade fará com que o corante fluorescente desapareça rapidamente durante a varredura contínua, e o sinal fluorescente ficará cada vez mais fraco à medida que a varredura avança.
2) A fototoxicidade é outro problema. Sob irradiação a laser, muitas moléculas de corante fluorescente produzirão citotoxinas, como oxigênio singleto ou radicais livres, portanto, o tempo de varredura e a densidade de potência óptica da luz de excitação devem ser limitados no experimento para manter a densidade da amostra. ativo. Na pesquisa de amostras ativas, principalmente nas diversas fases do crescimento e desenvolvimento das amostras ativas, o fotobranqueamento e a fototoxicidade tornam esses estudos muito limitados.
2. Por que você diz que os microscópios de dois fótons geralmente não precisam ser equipados com lasers de excitação ultravioleta?
A microscopia de dois fótons é uma tecnologia de excitação de fluorescência baseada no efeito de excitação de dois fótons: moléculas de corante fluorescente podem ser excitadas pela absorção de dois fótons de baixa energia ao mesmo tempo (o intervalo de tempo entre dois fótons atingindo moléculas fluorescentes é inferior a 1 femtosegundo ), seu efeito de excitação pode ser equivalente à absorção de um fóton de alta energia de 1/2 comprimento de onda. Por exemplo, absorver dois fótons em comprimentos de onda vermelhos é equivalente a uma molécula absorvendo ultravioleta. Os fótons de comprimento de onda longo não são facilmente absorvidos pelas células, portanto, a fototoxicidade para as células vivas é reduzida e o fotobranqueamento também é reduzido. Desta forma, não só desempenha a função de excitação ultravioleta, mas também evita o dano da luz ultravioleta à amostra.
3. O que há de especial no laser do microscópio de dois fótons?
A probabilidade de absorção de dois fótons depende de quão próximos os dois fótons incidentes coincidem no espaço e no tempo (os dois fótons devem chegar em 10-18 segundos). A seção transversal de absorção de dois fótons é pequena e apenas os fluoróforos em regiões com um grande fluxo de fótons são excitados. Portanto, a maioria dos lasers utilizados são lasers de safira de titânio, que podem atingir velocidades de escaneamento de picossegundos ou femtossegundos e têm potência de pico muito alta e baixa potência média, de modo que o fotobranqueamento e a fototoxicidade podem ser reduzidos ou eliminados. O mais importante é fornecer uma densidade muito alta de fótons em uma faixa pequena, o que pode garantir a excitação simultânea de dois fótons.
4. Quais são as vantagens da excitação de dois fótons?
1) Aumente a seletividade do corante: a faixa de luz de excitação do laser do sistema confocal (Ar, Ar/Kr, HeNe) é 488nm - 647nm. Isso significa experimentar corantes fluorescentes excitados por UV, por exemplo, com DAPI , Hoescht. O comprimento de onda de excitação de dois fótons é o dobro do fóton único, então corantes excitados por ultravioleta podem ser excitados por luz infravermelha próxima.
2) Reduzir o fotobranqueamento: devido à redução do fotobranqueamento, a taxa de sucesso dos experimentos usando CFP/YFP para transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) aumenta.
3) Nenhuma lente objetiva especial é necessária: Do ponto de vista do hardware, a excitação de corantes excitados por UV com o comprimento de onda da luz infravermelha próxima não requer componentes ópticos UV especiais.
4) Melhorar a relação sinal-ruído: o comprimento de onda da luz de excitação e o comprimento de onda da luz emitida têm uma grande diferença, o que melhora a relação sinal-ruído.
5) Branqueamento localizado no ponto focal: Como a excitação da fluorescência ocorre apenas no ponto focal da objetiva, não há necessidade de um orifício confocal. Isso melhora a detecção de luz e o fotobranqueamento ocorre apenas no ponto focal.
6) Mais fácil de penetrar nos espécimes: A luz infravermelha do comprimento de onda não é facilmente espalhada pelas células e pode penetrar nos espécimes mais profundos.
5. Em comparação com a microscopia confocal de varredura a laser, qual é a maior melhoria feita pela microscopia de dois fótons?
1) Fotobranqueamento reduzido.
2) Fototoxicidade reduzida.
3) Não é fácil de espalhar e é mais fácil penetrar em amostras espessas, como fatias de cérebro.
