Estrutura e principais componentes de um microscópio de fluorescência
A microscopia de fluorescência é uma ferramenta essencial na citoquímica de imunofluorescência. É composto de componentes principais, como fonte de luz, sistema de placa de filtro e sistema óptico. É usar um certo comprimento de onda de luz para excitar o espécime para emitir fluorescência e observar a imagem de fluorescência do espécime amplificando a lente objetiva e o sistema ocular.
Estrutura e principais componentes de um microscópio de fluorescência
(1) Fonte de luz
Hoje em dia, as lâmpadas de mercúrio de pressão ultra-alta de 200 W são frequentemente usadas como fontes de luz. Eles são feitos de vidro de quartzo, com uma forma esférica no meio, e uma certa quantidade de mercúrio é preenchida no interior. Durante o trabalho, a descarga entre os dois eletrodos faz com que o mercúrio evapore e a pressão do ar na bola aumenta rapidamente. Quando o mercúrio é completamente evaporado, ele pode atingir 50-70 pressão atmosférica padrão, e esse processo geralmente leva cerca de 5-15 minutos. A luminescência da lâmpada de mercúrio de ultra-alta pressão é o resultado da emissão de quanta de luz durante a contínua dissociação e redução das moléculas de mercúrio pela descarga entre os eletrodos. Ele emite forte luz ultravioleta e azul-violeta, o que é suficiente para excitar várias substâncias fluorescentes, por isso é amplamente utilizado em microscopia de fluorescência.
As lâmpadas de mercúrio de ultra-alta pressão também emitem muito calor. Portanto, a casa da lâmpada deve ter boas condições de dissipação de calor e a temperatura do ambiente de trabalho não deve ser muito alta.
A nova lâmpada de mercúrio de ultra-alta pressão pode ser acesa sem alta tensão no início do uso. Após um período de uso, ele precisa ser iniciado em alta tensão (cerca de 15000V). Após o início, a tensão de trabalho de manutenção é geralmente 50-60V e a corrente de trabalho é de cerca de 4A. A vida útil média de uma lâmpada de mercúrio de ultra alta pressão de 200 W é de cerca de 200 horas se for usada por 2 horas de cada vez. Quanto menor o tempo de trabalho, menor a vida útil. Se for usado apenas por 20 minutos, a vida útil será reduzida em 50%. Portanto, minimize o número de partidas ao usá-lo. Durante o uso da lâmpada, sua eficácia luminosa é gradualmente reduzida. Depois que a luz se apagar, espere que ela esfrie antes de reiniciar. Não desligue a lâmpada imediatamente após acendê-la, para não danificar o eletrodo devido à evaporação incompleta do mercúrio. Geralmente, ele precisa esperar por 15 minutos. Devido à alta pressão da lâmpada de mercúrio de ultra-alta pressão e aos fortes raios ultravioleta, a lâmpada deve ser colocada na câmara da lâmpada antes de ser acesa, para não danificar os olhos e causar operação em caso de explosão .
O circuito da fonte de luz da lâmpada de mercúrio de ultra alta pressão (100W ou 200W) e várias partes, incluindo transformador, reator e partida. Existe um sistema para ajustar o centro luminoso da lâmpada na câmara da lâmpada. Um refletor côncavo revestido de alumínio é instalado atrás da lâmpada e uma lente coletora de luz é instalada na frente.
A lâmpada doméstica de mercúrio de ultra alta pressão GCQ-200 tem bom desempenho e pode substituir lâmpadas importadas, como HBO-200. A vida útil média é superior a 200h e o preço é relativamente baixo.
Um dispositivo simples e portátil de fonte de luz fluorescente de bromo e tungstênio desenvolvido em meu país tem tamanho pequeno, peso leve, baixa potência, uso duplo AC e DC (com fonte de alimentação DC), fácil de transportar, fácil de usar e tem foi popularizado e aplicado.
(2) Sistema de filtro de cores
O sistema de filtro de cor é uma parte importante do microscópio de fluorescência, que consiste em uma placa de filtro de excitação e uma placa de filtro de pressão. O modelo da placa do filtro e o nome de cada fabricante geralmente não são uniformes. As placas do filtro geralmente recebem o nome da cor básica, as letras na frente representam a cor, as letras na parte de trás representam o vidro e os números representam as características do modelo. microscópio olympus
(3) Lente objetiva
Várias lentes objetivas podem ser usadas, mas lentes objetivas acromáticas são usadas porque sua autofluorescência é mínima e suas propriedades de transmissão de luz (faixa de comprimento de onda) são adequadas para fluorescência. Uma vez que o brilho da fluorescência da imagem no campo de visão do microscópio é proporcional ao quadrado da taxa de abertura da lente objetiva e inversamente proporcional à sua ampliação, a fim de melhorar o brilho da imagem de fluorescência, uma lente objetiva com um grande taxa de abertura deve ser usada. Especialmente em alta ampliação, seu efeito é muito óbvio. Portanto, para amostras com fluorescência insuficiente, uma lente objetiva com uma grande taxa de abertura deve ser usada com uma ocular o mais baixa possível (4×, 5×, 6,3×, etc.).
(4) Espelho
A camada reflexiva do refletor é geralmente revestida de alumínio, porque o alumínio absorve menos na região azul-violeta da luz ultravioleta e da luz visível, e a reflexão é superior a 90%, enquanto a reflexão da prata é de apenas 70%. Geralmente, um refletor plano é usado.
(5) Condensador
Os condensadores projetados para microscopia de fluorescência são feitos de vidro de quartzo ou outro vidro transparente aos raios UV. Existem dois tipos de condensadores de campo claro e condensadores de campo escuro. Existem também concentradores de fluorescência de contraste de fase.
(6) Dispositivo de epi-luz
O novo tipo de dispositivo de epi-luz é que, após a luz da fonte de luz atingir o filtro espectroscópico de interferência, a parte do comprimento de onda curto (ultravioleta e azul roxo) é refletida devido às propriedades do revestimento do filtro. Quando o filtro está voltado para a fonte de luz, o ângulo é de 45. Quando é inclinado, ele dispara para a lente objetiva verticalmente e dispara para a amostra através da lente objetiva, de modo que a amostra seja excitada. Neste momento, a lente objetiva atua diretamente como um coletor de luz. Ao mesmo tempo, a parte longa do filtro (verde, amarelo, vermelho, etc.) é transparente para o filtro, portanto não reflete na direção da lente objetiva e o filtro atua como uma placa de filtro de excitação, porque a fluorescência da amostra está na região de longo comprimento de onda da luz visível, pode passar pelo filtro e alcançar a ocular para observação, o brilho da imagem fluorescente aumenta com o aumento da ampliação e é mais forte que a luz transmitida fonte em alta ampliação. Além da função de fonte de luz de transmissão, é mais adequado para observação direta de espécimes opacos e translúcidos, como fatias grossas, membranas de filtro, colônias e espécimes de cultura de tecidos. Os novos microscópios de fluorescência desenvolvidos nos últimos anos usam principalmente dispositivos de epi-luz, que são chamados de microscópios de epi-fluorescência.
