Requisitos para a preparação de amostras de rotina para microscopia
O microscópio confocal é um novo produto de alta tecnologia que marcou época desenvolvido na década de 1980 e é um dos instrumentos analíticos importantes em biologia molecular e ciências da vida atualmente. A microscopia confocal é baseada na imagem do microscópio de fluorescência com um dispositivo de varredura a laser adicionado, usando um computador para processamento de imagem para obter imagens fluorescentes da microestrutura dentro das células ou tecidos e observar mudanças na morfologia de muitas máquinas de sinal fisiológico no nível subcelular. Torne-se uma poderosa ferramenta de pesquisa nas áreas de morfologia, biologia celular molecular, neurociência, farmacologia, genética e outras áreas científicas.
A preparação da amostra para microscopia confocal é uma etapa crítica antes da detecção. As amostras precisam ser marcadas com sondas fluorescentes (simples, duplas, triplas).
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As amostras podem ser tecidos fixos ou vivos, ou culturas aderentes fixas ou vivas. As células devem ser cultivadas em pequenas placas de cultura ou lamínulas especiais da Confocal. Suspenda as células, agite ou solte as fatias e cubra com lamínulas. A espessura Zda da amostra é de cerca de 1 a 2 mm, a espessura da lamínula usada deve ser inferior a 0,17 mm e a espessura da lâmina de vidro deve estar entre 0,8 a 1,2 mm, e a superfície é lisa, a espessura é uniforme e não há fluorescência de interferência óbvia. O meio de montagem é frequentemente usado para amostras fixas e o glicerol preparado em PBS com um pH de 8.5-9 é comumente usado para montagem.
Requisitos de preparação de amostra de rotina:
1. Seleção de corantes
Como o microscópio confocal usa um laser de comprimento de onda único como fonte de luz, a escolha dos corantes fluorescentes deve ser baseada no comprimento de onda do laser equipado com o microscópio confocal. Se houver vários corantes fluorescentes na mesma amostra, seu comprimento de onda de emissão também deve ser considerado tanto quanto possível. Não sobreponha para evitar problemas de cores cruzadas.
2. Seleção do transportador de amostras
Geralmente, a lente objetiva de alta potência do microscópio confocal é uma lente de óleo, sua abertura numérica é pequena e a distância de trabalho entre a lente e a amostra não deve ser superior a 0,17 mm. Lâminas e lamelas estão bem. Se forem células suspensas ou partículas suspensas, uma placa de Petri dedicada a um microscópio confocal pode ser usada para transportar a amostra para observação.
3. Seleção do meio de montagem
Se a amostra precisar ser observada apenas uma vez e a fluorescência não for facilmente extinta, você pode escolher uma certa concentração de mistura de glicerol para selar a lâmina. Se a amostra precisar ser colocada por um período de tempo e coletada várias vezes, um meio de montagem de extinção antifluorescência deve ser selecionado para reduzir a perda de sinais fluorescentes.
