Princípio e construção do microscópio de fluorescência
O microscópio de fluorescência usa uma fonte de luz pontual de alta eficiência luminosa, que emite um determinado comprimento de onda de luz (como luz ultravioleta de 3.650 pol. ou luz azul violeta de 4.200 pol.) através de um sistema de filtragem de cores como luz de excitação, e excita as substâncias fluorescentes na amostra para emitem várias cores de fluorescência. Depois disso, é observado através da ampliação da objetiva e da ocular. Desta forma, mesmo com fluorescência fraca, é facilmente reconhecível e altamente sensível sob fundos fortemente contrastantes, utilizado principalmente para estudar a estrutura e função celular, bem como a composição química. A estrutura básica de um microscópio de fluorescência é composta por um microscópio óptico comum e alguns acessórios (como fonte de luz fluorescente, filtro de excitação, separador de feixe bicromático e filtro de bloqueio, etc.). Fontes de luz fluorescente - geralmente usam lâmpadas de mercúrio de ultra-alta pressão (50-200W), que podem emitir luz de vários comprimentos de onda. No entanto, cada substância fluorescente tem um comprimento de onda de luz de excitação que produz a fluorescência mais forte, portanto, filtros de excitação (geralmente filtros de excitação ultravioleta, roxo, azul e verde) precisam ser adicionados para permitir que apenas um determinado comprimento de onda de luz de excitação passe e ilumine. amostra, enquanto absorve todas as outras luzes. Após ser irradiada por luz excitada, cada substância emite fluorescência visível com comprimento de onda maior que a irradiação em um período de tempo muito curto. A fluorescência tem especificidade e geralmente é mais fraca que a luz de excitação. Para observar fluorescência específica, um filtro de bloqueio (ou supressão) precisa ser adicionado atrás da lente objetiva. Tem duas funções: em primeiro lugar, absorve e bloqueia a entrada de luz de excitação na ocular para evitar perturbar a fluorescência e danificar os olhos; em segundo lugar, seleciona e permite a passagem de fluorescência específica, exibindo uma cor de fluorescência específica. Ambos os tipos de filtros devem ser selecionados para uso conjunto.
Existem dois tipos de microscópios de fluorescência com base em seu caminho óptico:
1. Microscópio de fluorescência de transmissão: A fonte de luz de excitação é transmitida através do material da amostra através de um condensador para excitar a fluorescência. Coletores de luz de campo escuro comumente usados, ou coletores de luz comuns, podem ser usados para ajustar o refletor para converter luz de excitação e luz lateral na amostra. Este é um microscópio de fluorescência relativamente antiquado. Sua vantagem é que a fluorescência é forte em baixa ampliação, enquanto sua desvantagem é que a fluorescência enfraquece à medida que a ampliação aumenta. Portanto, é melhor observar materiais de amostras maiores.
2. Microscópio de fluorescência de feixe descendente Este é um novo tipo de microscópio de fluorescência desenvolvido nos tempos modernos. Ao contrário do anterior, a luz de excitação desce da lente objetiva até a superfície da amostra, usando a mesma lente objetiva do condensador de iluminação e a lente objetiva para coleta de fluorescência. Um separador de feixe de duas cores precisa ser adicionado ao caminho óptico, que forma um ângulo de 45 graus em relação ao urânio leve. A luz de excitação é refletida na lente objetiva e concentrada na amostra. A fluorescência gerada pela amostra, bem como a luz de excitação refletida na superfície da lente objetiva e da lamela, entram na lente objetiva simultaneamente e retornam ao separador de feixe dicróico, separando a excitação e a fluorescência. A excitação residual é então absorvida pelo filtro de bloqueio. Se diferentes filtros de excitação/separadores de feixe de cor dupla/combinações de filtros de bloqueio forem usados, eles poderão atender às necessidades de diferentes produtos de reação fluorescente. A vantagem deste microscópio fluorescente é que a iluminação do campo de visão é uniforme, a imagem é nítida e quanto maior a ampliação, mais forte será a fluorescência.
