Propriedades ópticas de microscópios biológicos
O desempenho óptico do microscópio é determinado pelos seguintes oito parâmetros ópticos básicos (ou parâmetros):
(1) Abertura numérica
A abertura numérica também é chamada de proporção de espelho. Refere-se ao produto do índice de refração n do meio entre o objeto observado e a lente e o valor do seno da metade do ângulo da lente objetiva. Use NA ou A. para representar. NA=nsin( /2)
O chamado ângulo da boca do espelho refere-se ao ângulo entre os raios marginais do ponto observado entrando na lente frontal da lente objetiva.
A abertura numérica é um parâmetro importante da lente objetiva e da lente condensadora e está intimamente relacionada a outros parâmetros ópticos do microscópio. Geralmente, espera-se que quanto maior, melhor. Pode-se ver pela fórmula que existem duas maneiras de aumentar a abertura numérica, uma é aumentar o ângulo da boca do espelho e a outra é aumentar o índice de refração entre a lente objetiva e a amostra.
Quando o primeiro método é adotado, a amostra e o objeto podem ser mantidos o mais próximo possível. Mas não importa o quão perto, é sempre menor que 180 graus. Assim, sin( /2) também é menor que 1. O índice de refração do ar é n=1. Portanto, a abertura numérica nsin( /2) da objetiva seca é sempre menor que 1, geralmente entre 00,04 e 0,95.
Quando o último método é adotado, um meio com um índice de refração mais alto pode ser adicionado entre a lente objetiva e a amostra. Por exemplo, o índice de refração do óleo de cedro é n=1.515. Quando o óleo de cedro é usado como meio, a abertura numérica pode atingir mais de 1,2. É por isso que em alguns casos são usados óculos de óleo. Atualmente, a abertura numérica máxima que a lente de óleo pode atingir é de 1,4.
(2) Resolução
A resolução também é chamada de taxa de discriminação ou poder de resolução. A chamada resolução refere-se à capacidade do microscópio em distinguir a estrutura fina do objeto sob inspeção. É inversamente proporcional à distância de resolução. A distância de resolução refere-se à distância mínima entre dois pontos do objeto que podem ser distinguidos. Quanto menor a distância de resolução, maior a resolução do microscópio. Se a distância entre dois pontos do objeto for menor que a distância de resolução, os dois pontos serão confundidos com um ponto e sua estrutura não poderá ser vista claramente. A resolução do microscópio é determinada pela lente objetiva. As oculares apenas ampliam e não aumentam a resolução do microscópio.
No caso de iluminação central normal, a distância de resolução d da lente objetiva é determinada pela seguinte fórmula.
d=(λ/2)N.A.
Na fórmula: d representa a distância de resolução, a unidade é mícron, λ representa o comprimento de onda da luz de iluminação, a unidade também é mícron.
Na luz visível, o comprimento de onda com maior brilho e maior sensibilidade aos olhos humanos é {{0}},55 μm, e o NA máximo da lente objetiva é 1,4. Substituindo na fórmula acima, d é aproximadamente 0,2 μm. Ou seja, com um microscópio óptico comum, o limite da distância de resolução é 0,2 μm no caso de iluminação central. Ou seja, os microscópios ópticos comuns não conseguem distinguir entre dois objetos menores que 0,2 μm.
Usando luz ultravioleta, o comprimento de onda da luz de iluminação pode ser reduzido, permitindo que a distância de resolução alcance 0,1 μm. Mas os raios ultravioleta não podem ser vistos pelo olho humano. Só pode ser observado depois de tirar uma foto.
O comprimento de onda do fluxo de elétrons é apenas 0.00387nm. Usando "lentes eletrônicas" ou lentes magnéticas para controlar o fluxo de elétrons, a distância de resolução do microscópio eletrônico é de até alguns décimos de nanômetro. Pode ser usado para observar a estrutura dos átomos.
(3) Ampliação
A ampliação do microscópio é igual ao produto da ampliação da lente objetiva e da ampliação da ocular. Em princípio, a ampliação pode ser muito grande. No entanto, se os detalhes da amostra não puderem ser resolvidos pela lente objetiva, não importa quão grande seja a ampliação, ela não terá sentido. Teoricamente, pode-se deduzir que a ampliação mais adequada do microscópio (chamada ampliação efetiva, representada por M efetivamente) está entre 500 e 1000 vezes a abertura numérica da lente objetiva. Ou seja, 500N.A. Menor ou igual a M efetivo Menor ou igual a 1000N.A.
Dentro da faixa de ampliação efetiva, os olhos podem observar por um longo tempo sem fadiga. Se a ampliação for inferior a 500 NA, será difícil observar. Se for superior a 1000N.A., deteriorará a qualidade da imagem e até causará uma imagem irreal. Portanto, a ampliação acima de 1000N.A. é chamado de ampliação inválida.
(4) Distância de trabalho
A distância de trabalho refere-se à distância entre a superfície inferior da lente objetiva e a superfície superior da lamela após o foco do microscópio, usando uma lamínula padrão e um comprimento de tubo mecânico padrão. Quanto maior a ampliação da lente objetiva, menor a distância de trabalho. Geralmente, a distância de trabalho da lente objetiva de baixa potência abaixo de 10 vezes é 5-7mm, enquanto a distância de trabalho da lente de óleo 100 vezes é apenas cerca de 0,19 mm.
(5) Profundidade de foco
Quando o microscópio é focado em um determinado plano na amostra, não apenas o plano do objeto pode ser visto claramente, mas também os planos superior e inferior do objeto conectados a ele podem ser vistos claramente ao mesmo tempo. A distância entre os planos de objeto superior e inferior é chamada de profundidade de foco, ou profundidade de foco para abreviar.
A profundidade de foco do microscópio é muito pequena e quanto maior a abertura numérica, maior a ampliação total e menor a profundidade de foco. Por exemplo, ao usar uma lente de óleo com um NA de 1,25/100 vezes e uma ocular de 12,5 vezes para observar, a profundidade de foco é de apenas 0,27 μm. Ou seja, após o foco, apenas uma fina camada de 0,27 μm de espessura pode ser vista claramente por vez. Espécimes comuns geralmente têm vários mícrons de espessura. Para ver o espécime inteiro, é necessário usar o mecanismo de ajuste fino do microscópio para observar em camadas de cima para baixo.
(6) campo de visão
O campo de visão também é chamado de campo de visão. Refere-se ao escopo do objeto sob inspeção que o microscópio pode ver ao mesmo tempo. Normalmente, queremos que o campo de visão seja o maior possível. O campo de visão do microscópio é determinado pelo campo de visão da lente objetiva e pelo campo de visão da ocular. O campo de visão da lente objetiva comum é inferior a 20 mm e a grande pode atingir mais de 40 mm. O campo de visão das oculares comuns de 10x é de 14 mm e as grandes podem atingir mais de 24 mm. Uma vez que a objetiva e a ocular são projetadas, seu campo de visão é fixo. Como o campo de visão de um microscópio geral é pequeno, é impossível ver toda a amostra em um campo de visão, apenas um círculo muito pequeno na amostra pode ser visto. Além disso, o tamanho do campo de visão é inversamente proporcional à ampliação total do microscópio. Quanto maior a ampliação total, menor o campo de visão. A solução é usar o motor para fazer com que cada parte do espécime entre no campo de visão por vez e observe por vez.
(7) Brilho do espelho
O brilho do espelho refere-se à claridade e escuridão da imagem do objeto visto no microscópio. Para facilitar a observação, esperamos que a imagem resultante seja mais brilhante. No caso de luz externa constante, o brilho do espelho é proporcional ao quadrado da abertura numérica e inversamente proporcional ao quadrado da ampliação total. Para tornar a imagem mais clara, uma lente objetiva com grande abertura numérica deve ser usada com uma ocular de baixa ampliação. Por exemplo, no caso da mesma lente objetiva, usar uma ocular 5X produzirá uma imagem espelhada 4 vezes mais brilhante do que usar uma ocular 10X.
Para microscópios que usam fontes de luz elétrica, o brilho da imagem espelhada pode ser controlado ajustando o brilho do iluminador.
(8) Clareza
A clareza da imagem do microscópio depende de seu sistema óptico, especialmente o desempenho óptico da lente objetiva. Está relacionado ao projeto, fabricação, uso e armazenamento de microscópios. É uma questão importante e complexa. Do ponto de vista de uso e armazenamento, os principais motivos que afetam a clareza são: a espessura da lamela utilizada não é qualificada, o foco não está ajustado na posição ideal, a ampliação total é muito grande e a lente do óleo lente não é limpa. Limpeza, mofo da lente, etc.
