Imagens de microscopia multifotônica: diversas técnicas para imagens de neurônios in vivo
Comparado com o tradicional microscópio de fluorescência de campo amplo de fóton único, a microscopia multifóton (MPM) tem as funções de seccionamento óptico e imagem profunda. Em 2019, Jerome Lecoq et al. discutiu a tecnologia MPM relacionada a partir de três aspectos: imagens de neurônios no fundo do cérebro, imagens de neurônios massivos e imagens de neurônios de alta velocidade.
Para vincular a atividade dos neurônios com o comportamento complexo, geralmente é necessário gerar imagens de neurônios no córtex profundo, o que requer que o MPM tenha a capacidade de gerar imagens profundas. A luz de excitação e emissão será altamente espalhada e absorvida pelo tecido biológico, que é o principal fator que limita a profundidade de imagem do MPM. Embora o problema de espalhamento possa ser resolvido aumentando a intensidade do laser, ele trará outros problemas, como queima da amostra, desfocagem e excitação fluorescente próxima à superfície. A melhor maneira de aumentar a profundidade da imagem MPM é usar comprimentos de onda mais longos como luz de excitação.
Além disso, para imagens de dois fótons (2P), a excitação de fluorescência fora de foco e perto da superfície são os dois maiores fatores limitantes de profundidade, enquanto para imagens de três fótons (3P), esses dois problemas são bastante reduzidos, mas geração de imagens de três fótons devido à fluorescência A seção transversal de absorção do grupo é muito menor do que a de 2P, portanto, uma energia de pulso de ordem de magnitude maior é necessária para obter o mesmo sinal de fluorescência de intensidade que o excitado por 2P. A microscopia 3P funcional é mais exigente do que a microscopia 3P estrutural, que requer varredura mais rápida para amostrar a atividade neuronal no tempo; energia de pulso mais alta é necessária para coletar sinais suficientes dentro do tempo de permanência de cada pixel.
Comportamentos complexos geralmente envolvem grandes redes cerebrais com conexões locais e de longo alcance. Para vincular a atividade do neurônio com o comportamento, é necessário monitorar a atividade de neurônios muito grandes e amplamente distribuídos ao mesmo tempo. A rede neural no cérebro processa os estímulos recebidos em dezenas de milissegundos. Para entender essa rede neural rápida Para estudar a dinâmica dos neurônios, é necessário que o MPM tenha a capacidade de gerar imagens rapidamente dos neurônios. Os métodos MPM rápidos podem ser divididos em técnicas de varredura de feixe único e técnicas de varredura de feixe múltiplo.
A tecnologia de varredura de feixe único permite a passagem em alta velocidade do tecido neural com um grande campo de visão (FOV)
Ao usar o MPM para gerar imagens de neurônios, a varredura de acesso aleatório - ou seja, o feixe de laser é rapidamente varrido em qualquer ponto selecionado em todo o campo de visão - pode escanear apenas os neurônios de interesse, o que não apenas evita a varredura de quaisquer fibras nervosas não rotuladas como também também otimiza o tempo de varredura do feixe de laser. A varredura de acesso aleatório (Fig. 1) pode ser obtida com um defletor acústico-óptico (AOD), que funciona ligando um transdutor piezoelétrico com um sinal de radiofrequência a um cristal adequado. As ondas acústicas resultantes induzem uma grade de índice de refração periódica. A difração ocorre quando um feixe de laser passa por uma grade. A intensidade e a frequência da onda sonora podem ser ajustadas pelo sinal elétrico de radiofrequência para alterar a intensidade e a direção da luz difratada, de modo que a varredura de ponto arbitrário horizontal unidimensional possa ser realizada usando um AOD e 3D possa ser realizado usando um par de AODs combinado com outras tecnologias de varredura axial, varredura de acesso aleatório. No entanto, esta técnica é muito sensível ao movimento da amostra e propensa a artefatos de movimento. Atualmente, a varredura raster rápida, ou seja, varredura progressiva em FOV, é amplamente utilizada porque o algoritmo pode resolver facilmente os artefatos de movimento.
Imagem de dois fótons baseada em AOD de neurônios L2/3 neocorticais in vivo[2]
Existem muitas maneiras de realizar uma varredura raster rápida, usando um espelho vibratório para varredura 2D rápida, combinando um espelho vibratório e uma lente elétrica ajustável para varredura 3D rápida, mas a lente elétrica ajustável não pode focar rapidamente na direção axial devido à limitação de A comutação de inércia mecânica, que afeta a velocidade da imagem, agora pode ser substituída por um modulador de luz espacial (SLM).
O foco remoto também é um meio de obter imagens 3D, conforme mostrado na Figura 2. No módulo LSU, o galvanômetro de varredura faz a varredura horizontalmente e o módulo ASU inclui a lente objetiva L1 e o espelho M, e a varredura axial é realizada ajustando a posição de M. Esta técnica pode não só corrigir a aberração óptica introduzida pela lente objetiva principal L2, mas também permitir uma varredura axial rápida. Para obter mais imagens de neurônios, o FOV pode ser ampliado ajustando o design da lente objetiva do microscópio, mas a lente objetiva com grande NA e grande FOV geralmente é pesada e não pode se mover rapidamente para varredura axial rápida, então grandes sistemas de FOV dependem do telefoco , SLM e lentes motorizadas ajustáveis.
Diagrama esquemático de um sistema de imagem de dois fótons com foco remoto
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm de distância) locais de imagem (Fig. 3C,D); para regiões adjacentes, geralmente usa feixes múltiplos de uma única lente objetiva para geração de imagens (Fig. 3E,F). A técnica de varredura multifeixe deve prestar atenção especial ao problema de diafonia entre feixes de excitação, que pode ser resolvido pelo método de separação de fonte pós-luz ou pelo método de multiplexação espaço-tempo. O método post-hoc de separação da fonte de luz refere-se ao uso de algoritmos para separar os feixes para eliminar o crosstalk; o método de multiplexação espaço-tempo refere-se ao uso simultâneo de vários feixes de excitação, os pulsos de cada feixe são atrasados no tempo, de modo que os feixes individuais excitados por diferentes feixes possam ser temporariamente separados. sinal fluorescente. Mais neurônios podem ser visualizados pela introdução de mais feixes, mas vários feixes aumentarão a sobreposição do tempo de decaimento da fluorescência, o que limita a capacidade de distinguir as fontes de sinal; e a multiplexação tem um impacto negativo na velocidade de trabalho dos dispositivos eletrônicos. Altas exigências; um grande número de feixes também requer maior potência do laser para manter uma relação sinal-ruído aproximada de um único feixe, o que pode facilmente levar a danos nos tecidos.
Tecnologia de imagem de grande área
Nos últimos anos, o desenvolvimento de diferentes tecnologias de MPM ampliou o escopo de nossa geração de imagens do tecido neural, permitindo-nos obter imagens de mais neurônios profundos no cérebro em uma velocidade mais rápida, o que promoveu muito a pesquisa em neurociência e nos permitiu obter uma compreensão mais clara da função cerebral.
