Sala de Aula de Imagem Microscópica丨Microscópio de Fluorescência de Campo Amplo
Em aplicações de imagens de células vivas, a microscopia de fluorescência de campo amplo facilita a observação da dinâmica de células aderentes cultivadas em câmaras ambientais específicas colocadas na platina do microscópio. Em sua configuração mais básica, um microscópio de cultura de tecidos invertido padrão equipado com iluminação de fluorescência EPI é acoplado a um sistema detector de matriz de área (geralmente uma câmera CCD), filtros de fluorescência adequados e um sistema de obturador para limitar a exposição excessiva de células à luz de excitação prejudicial . A microscopia básica de fluorescência depende de filtros de interferência cuidadosamente combinados para selecionar larguras de banda específicas para iluminação e detecção da luz emitida. As fontes de luz incluem lâmpadas de arco de mercúrio, xenônio e iodetos metálicos, sistemas laser de expansão de feixe e diodos emissores de luz (LEDs), todos os quais requerem especificações de filtro diferentes. Os fluoróforos sintéticos usados na microscopia de fluorescência têm espectros de emissão que cobrem as regiões do ultravioleta próximo, do visível e do infravermelho próximo. O uso de proteínas fluorescentes codificadas geneticamente expandiu muito os recursos da microscopia de fluorescência em imagens de células vivas, permitindo que os pesquisadores visem com precisão as regiões subcelulares de interesse.
Nuohai LS 18, um novo tipo de microscópio de iluminação de folha de luz desenvolvido independentemente pela Nuohai, é especialmente projetado para imagens 3D de alta resolução de grandes amostras de tecidos transparentes e é dedicado a explorar vários tecidos intactos, como cérebro, baço, intestino delgado , rim, pulmão, coração e tumor. Estrutura precisa 3D dos órgãos.
Na fluorescência de campo amplo, a emissão de abertura total coletada pela objetiva do microscópio maximiza o sinal registrado enquanto minimiza o tempo de exposição necessário. Assim, as amostras podem ser visualizadas com períodos de luz muito curtos. A principal desvantagem da imagem de campo amplo é que a fluorescência de regiões distantes do plano focal, bem como o sinal de fundo, é uma luz indesejada que muitas vezes obscurece as características de interesse. Portanto, a imagem de campo amplo produz os melhores resultados quando as características de interesse são grandes (como organelas) ou de natureza altamente pontuada. Uma ampla variedade de amostras de células vivas, incluindo células aderentes, bactérias, leveduras e seções de tecidos muito finos, são candidatos ideais para imagens de fluorescência de campo amplo;
Embora tenha havido muitos avanços na imagem fluorescente com corantes fluorescentes sintéticos, pontos quânticos e proteínas fluorescentes, em alguns casos é útil combinar a fluorescência com outras modalidades de imagem. Como exemplo, o DIC pode ser usado em conjunto com a fluorescência de campo amplo para monitorar a viabilidade celular e a morfologia geral enquanto estuda fenômenos de interesse para alvos marcados específicos. A aquisição de DIC e fluorescência em uma única imagem geralmente é impraticável, mas em um microscópio configurado adequadamente, as duas técnicas podem ser usadas sequencialmente. Assim, após a geração de imagens no modo de epifluorescência, as imagens DIC podem ser adquiridas a partir de amostras marcadas com fluorescência usando luz transmitida. As duas imagens podem ser mescladas durante a pós-análise. A aquisição simultânea de DIC e imagens de fluorescência é possível em configurações avançadas de microscópio de campo amplo usando iluminação espectralmente separada (como visível e infravermelho próximo) e adaptadores de câmera dupla ou de visão dividida. Na maioria dos microscópios confocais de varredura a laser, as imagens podem ser adquiridas nos modos de fluorescência e DIC simultaneamente, eliminando a necessidade de processamento pós-aquisição. O contraste de fase e o contraste de modulação Hoffman também podem ser usados em conjunto com a microscopia de fluorescência de campo amplo. No entanto, nessas técnicas, a lente objetiva é especial, seja um anel de fase ou uma placa de modulação Hoffman, ela causará uma perda de intensidade de emissão de 5-15 por cento .
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