Sala de Aula de Imagem Microscópica丨Aplicação da Microscopia de Fluorescência
A microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) é uma técnica que utiliza a onda evanescente gerada por um feixe de luz que se propaga entre dois meios de índice de refração diferentes para sondar a superfície de células vivas marcadas com fluorescência. Na prática, quando um feixe de laser incidente encontra a interface entre a lamínula e o meio aquoso contendo as células, ele é refletido no ângulo crítico (reflexão interna total). Como a energia da onda evanescente diminui exponencialmente com a distância da lamínula, apenas os fluoróforos a 10 nanômetros da superfície (entre 10 e 200 nanômetros) são excitados pela onda evanescente, enquanto os fluoróforos mais distantes não são excitados. Afetado. Assim, o TIRFM resulta em altos níveis de sinal de fluoróforos localizados próximos à lamínula, sobrepostos a um fundo muito escuro, proporcionando uma excelente relação sinal-ruído. A extrema limitação da profundidade de excitação é ideal para estudar moléculas individuais ou membrana e composição de organelas em células aderentes perto da superfície da lamínula (ver Figura 8(e)). Como a excitação é restrita a regiões finas perto da lamínula, o fotobranqueamento e a fototoxicidade também são restritos a essas regiões, tornando o TIRFM um dos métodos mais úteis para observação a longo prazo. A técnica tornou-se uma ferramenta fundamental para estudar uma ampla gama de fenômenos em biologia celular e molecular.
A deconvolução é um algoritmo aplicado a um conjunto de imagens de todos os focos adquiridas ao longo do eixo óptico (Z) para aprimorar o sinal do fóton em uma pilha de imagens para um determinado plano de imagem ou vários planos focais. Os microscópios devem ser equipados com unidades de foco motorizadas de alta precisão para garantir a aquisição de imagens em intervalos precisamente definidos entre os planos focais da amostra. Em uma aplicação típica (ver Fig. 8(f)), o processo de deconvolução é usado para desfocar e remover luz fora de foco de um determinado plano focal usando excitação e emissão de fluorescência de campo amplo. A aplicação mais complexa é aplicar o processo de deconvolução a toda a pilha de imagens para gerar visualizações projetadas ou modelos 3D. Um conjunto de imagens de campo amplo usadas para deconvolução captura o número máximo teórico de fótons emitidos pela amostra. O processo de deconvolução redistribui as intensidades "borradas" dos fótons emitidos acima e abaixo do plano focal de volta ao plano original. Assim, a deconvolução usa quase todas as intensidades de emissão disponíveis e fornece um orçamento de luz ideal, tornando essa técnica o método de escolha para amostras muito sensíveis à luz.
Uma variante do fenômeno de transferência de energia de ressonância em microscopia de fluorescência, fluorescência ou transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) é usada para obter informações temporais e espaciais quantitativas sobre a ligação e interação de proteínas, lipídios, enzimas e ácidos nucléicos em células vivas. O FRET pode empregar técnicas de estado constante ou resolução temporal, mas a imagem FRET resolvida no tempo tem a vantagem de mapear com mais precisão as distâncias doador-aceitador. Um microscópio de fluorescência de campo amplo padrão equipado com filtros apropriados de excitação e emissão e uma câmera sensível pode ser usado para imagens FRET. Os biossensores que colocam uma proteína ou peptídeo ambientalmente sensível entre duas proteínas fluorescentes aplicáveis ao FRET são atualmente amplamente utilizados em biologia celular. Essas sondas são facilmente visualizadas sob microscopia de fluorescência de campo amplo usando técnicas FRET de emissão sensibilizada combinadas com análise raciométrica. Além disso, imagens espectrais e unmixing linear usando microscopia confocal de varredura a laser podem ajudar a monitorar fenômenos FRET em biossensores e outras aplicações de proteínas fluorescentes.
A microscopia de imagem da vida útil da fluorescência (FLIM) é uma técnica sofisticada capaz de registrar simultaneamente a vida útil da fluorescência e a localização espacial de um fluoróforo em cada local da imagem. Este método fornece um mecanismo para estudar parâmetros ambientais, como pH, concentração iônica, polaridade do solvente, interações não covalentes, viscosidade e tensão de oxigênio em células vivas individuais e apresenta os dados em matrizes espaciais e temporais. As medições FLIM dos tempos de vida do estado excitado na escala de nanossegundos são independentes das concentrações locais de fluoróforo, efeitos de fotobranqueamento e comprimento do caminho (espessura da amostra), mas são sensíveis a reações do estado excitado, como transferência de energia de ressonância. De fato, combinar FLIM com FRET monitorando as mudanças de vida de doadores fluorescentes antes e depois da transferência de energia de ressonância é considerado uma das melhores maneiras de estudar esse fenômeno.
A mobilidade (coeficiente de difusão transversal) de macromoléculas marcadas com fluorescência e pequenos fluoróforos pode ser determinada pela técnica de recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP). No FRAP, uma área selecionada muito pequena (alguns micrômetros de diâmetro) é intensamente iluminada, geralmente com um laser, para produzir o fotobranqueamento completo do fluoróforo nessa área. O resultado é uma redução dramática ou aniquilação da fluorescência. Após um pulso de fotobranqueamento, a taxa e a extensão da recuperação da intensidade de fluorescência em regiões branqueadas foram monitoradas em função do tempo em baixas intensidades de excitação para gerar informações sobre a cinética de repovoamento e recuperação de fluoróforos (Figura 9). A FRAP geralmente é realizada usando EGFP ou outras proteínas fluorescentes. As técnicas de fotoativação relacionadas são baseadas em fluoróforos enjaulados sintéticos especiais ou proteínas fluorescentes funcionais semelhantes que podem ser ativadas por pulsos curtos de UV ou violeta. A fotoativação e o FRAP podem ser usados como técnicas complementares para determinar os parâmetros de mobilidade.
Em uma técnica relacionada ao FRAP, chamada perda de fluorescência após fotobranqueamento (FLIP), uma região fluorescente definida dentro de uma célula viva sofre fotobranqueamento repetido por irradiação intensa. Se todos os fluoróforos fossem capazes de se difundir na área sendo fotobranqueada durante o período de tempo medido, isso resultaria em uma perda completa do sinal fluorescente em toda a célula. Ao calcular a taxa na qual a fluorescência desaparece de toda a célula, a mobilidade difusional do fluoróforo alvo pode ser determinada. Além disso, o FLIP pode identificar prontamente a localização e a natureza de quaisquer barreiras difusionais entre compartimentos individuais de células, como a barreira entre o soma e o axônio de um neurônio.
A espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), usada principalmente em microscopia confocal de varredura a laser ou microscopia multifotônica, é um método projetado para determinar informações cinéticas, como taxas de reação química, coeficientes de difusão, técnicas de peso molecular, taxa de fluxo e agregação. No FCS, um pequeno volume (aproximadamente um femtômetro; o foco limitado por difração do laser) é iluminado com um feixe de laser focalizado para registrar as flutuações de intensidade da autofluorescência induzidas pela dinâmica das moléculas fluorescentes em função do tempo no volume ocupado pelas moléculas fluorescentes. moléculas (Fig. 10). Fluoróforos relativamente pequenos difundem-se rapidamente no volume iluminado, produzindo rajadas curtas de intensidade aleatória. Por outro lado, complexos maiores (fluoróforos ligados a macromoléculas) se movem mais lentamente, produzindo padrões de intensidade de fluorescência dependentes do tempo mais longos e persistentes.
Quando estruturas marcadas com fluorescência são densamente compactadas e se sobrepõem em regiões específicas de células vivas, sua dinâmica e distribuição espacial são difíceis de analisar. A microscopia de ponto de fluorescência (FSM) é uma técnica compatível com quase todas as modalidades de imagem que tira proveito de concentrações muito baixas de subunidades marcadas com fluorescência, reduz a fluorescência fora de foco e melhora a visibilidade de estruturas marcadas e sua dinâmica em regiões espessas. As FSMs são implementadas marcando apenas uma fração de toda a estrutura de interesse. Nesse sentido, o FSM é semelhante à execução do FCS em todo o campo de visão, embora coloque mais ênfase nos padrões espaciais do que na análise temporal quantitativa. A microscopia fluorescente é particularmente útil na determinação da mobilidade e agregação de elementos do citoesqueleto, como actina e microtúbulos em células hiperativas.
A microscopia de emissão estimulada (STED) é uma técnica emergente de super-resolução com resolução espacial muito além do limite de difração, usando luz empobrecida em forma de anel para cercar um feixe menor de luz de excitação para obter sub-50 nm no eixo para a resolução. A técnica se baseia na excitação de fluoróforos com pulsos de laser sincronizados e pulsos STED circulares espacialmente coordenados que esgotam a luz emitida, suprimindo a fluorescência de moléculas excitadas ao redor do foco de varredura a laser. A fluorescência gerada na periferia do ponto é suprimida, mas não no centro do ponto, reduzindo significativamente o tamanho do ponto fluorescente e aumentando significativamente a resolução. STED provou ser uma ferramenta útil para a detecção de alta resolução de células vivas. Outras técnicas emergentes de super-resolução, como a microscopia de localização fotoativada (PALM) e a microscopia de iluminação estruturada (SIM), também se tornarão ferramentas fundamentais para imagens de células vivas em um futuro próximo.
O uso crescente de proteínas fluorescentes codificadas geneticamente e fluoróforos sintéticos avançados para geração de imagens de células vivas abre as portas para novas modalidades ópticas para monitorar a dinâmica temporal e as relações espaciais. Os microscopistas agora têm um conjunto completo de ferramentas para observar e registrar dados de imagem de processos celulares que ocorrem em uma ampla gama de escalas de tempo e em múltiplas resoluções. Eventos mais lentos podem ser facilmente observados e registrados usando microscopia confocal de varredura a laser, enquanto eventos cinéticos mais rápidos podem ser obtidos usando tecnologia de disco giratório. Além disso, a microscopia multifotônica permite imagens profundas em tecidos espessos, e as técnicas de reflexão interna total permitem a sondagem de superfícies de membrana com precisão confocal. Métodos avançados de fluorescência, como FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM e STED, podem ser usados para monitorar interações proteína-proteína em resoluções muitas vezes melhores do que as permitidas pelo limite de difração. Com os avanços na tecnologia de fluoróforos, microscópios e detectores, um mundo mais amplo será colocado "sob o microscópio".
