Métodos para estender a profundidade focal de microscópios multifotônicos
A combinação de microscópio de varredura a laser de dois{0}fótons e indicador de cálcio é o padrão ouro para detecção de sinal neuronal in vivo. Os neurônios nas redes neurais são distribuídos no espaço tri-dimensional, e o monitoramento da dinâmica de sua atividade requer uma maneira de melhorar rapidamente a taxa de geração de imagens de volume. No entanto, usando um microscópio multifotônico de varredura de grade para obter imagens de um grande número de imagens, se uma objetiva de alta abertura numérica (NA) for usada para obter maior resolução lateral, isso resultará em uma profundidade focal menor. Para obter imagens de volume em uma pequena profundidade focal,
É necessário realizar a varredura do eixo Z-por alguns meios, criando imagens de muitos planos através da varredura de cada plano focal, o que limita bastante a velocidade da imagem. Se as informações da imagem axial puderem ser sacrificadas e a varredura do volume puder ser alcançada em uma varredura lateral estendendo a profundidade do foco, ou seja, a informação do volume for projetada em uma única imagem 2D, a velocidade da imagem poderá ser bastante melhorada. Isso é chamado de imagem de profundidade de foco estendida (EDF), que é particularmente útil para imagens de estruturas populacionais esparsas que requerem alta resolução temporal, como imagens funcionais de atividade neuronal.
As resoluções axial e lateral de um microscópio são determinadas pela abertura numérica (NA) da lente objetiva. Um NA alto pode maximizar a resolução axial e lateral, bem como a quantidade de luz coletada; Um NA mais baixo resultará em resolução axial mais baixa, ou seja, maior profundidade de foco, mas ao mesmo tempo sacrificará a resolução lateral e a eficiência de coleta de luz. O método de extensão da profundidade de foco que será apresentado a seguir pode conseguir isso enquanto mantém alta resolução lateral e fluxo luminoso suficiente.
O uso de moduladores de luz espacial para gerar feixes Bessel focais delgados pode obter imagens EDF, mas os moduladores de luz espacial são volumosos e difíceis de serem compatíveis com espaços estreitos de microscópio; Em contraste, os módulos Bessel baseados em pirâmides axiais são baratos e compactos, mas só podem gerar pontos focais de profundidade fixa e não são adequados para vários experimentos que requerem mudanças contínuas na profundidade focal. Para abordar esta questão, em 2018, RONGWEN LU et al. demonstraram um módulo Bessel baseado em um axicon, no qual apenas uma lente precisa ser transladada ao longo do eixo óptico para ajustar continuamente a distância axial do ponto focal de Bessel.
Figura 1 (a) Diagrama do dispositivo do módulo Bessel; (b) A função de dispersão de pontos foi medida experimentalmente quando D era -12mm, 0mm e 12mm, respectivamente; (c) A relação entre largura total lateral na metade do máximo, (d) largura total axial na metade do máximo, (e) sinal de pico e (f) potência óptica atrás da lente objetiva com deslocamento L2 D
O dispositivo modular para formar um ponto focal de Bessel de comprimento variável é mostrado na Figura 1a. O feixe gaussiano incidente é moldado em um feixe circular após passar por um axicon e lente L1. A máscara de abertura circular subsequente pode bloquear a luz dispersa causada por defeitos do axicon, moldando assim a distribuição axial da função de propagação do ponto de excitação de dois-fótons. Posteriormente, o feixe de luz é projetado no galvanômetro pelas lentes L2 e L3, e então atinge o plano focal traseiro da lente objetiva através das lentes L4 e L5.
Esses projetos são semelhantes aos módulos tradicionais baseados em pirâmide, com a diferença de que ao mover L2 ou L3 ao longo do eixo óptico, o comprimento axial do foco de Bessel pode ser ajustado continuamente. A Figura 1b mostra as funções de dispersão de pontos axiais para valores D de -12 mm, 0 mm e 12 mm, com largura total axial na metade do máximo de 39? m,24? M e 14? m. Conforme mostrado na Figura 1c-f, mover a lente L2 da esquerda para a direita pode alterar continuamente a largura total pela metade do máximo nas direções transversal e axial, o que significa que a profundidade do foco pode ser alterada continuamente. Os resultados da simulação numérica baseados na teoria da difração vetorial estão de acordo com os dados experimentais. A Figura 2 verifica o efeito de correção de diferentes tamanhos de máscaras anulares em defeitos axiconais. Verifica-se que máscaras anulares mais finas podem otimizar melhor a distribuição de intensidade axial do feixe de Bessel de saída, mas, ao mesmo tempo, também levam a mais perda de potência.
