Design de microscópio de fluorescência e campo claro de baixo custo
A microscopia de fluorescência é um método usado para visualizar
Neste guia, revisarei os fundamentos da microscopia de fluorescência e como construir três microscópios de fluorescência diferentes de baixo custo. Esses sistemas normalmente custam milhares de dólares, mas tem havido alguns esforços recentes para torná-los mais acessíveis. Os designs que apresento aqui usam um smartphone, dSLR e microscópio USB. Todos esses designs também podem ser usados como microscópios de campo claro.
Etapa 1: Visão geral da microscopia de fluorescência
Para entender os conceitos básicos da microscopia de fluorescência, imagine uma floresta densa à noite, com árvores, animais, arbustos e outras florestas vivas. Se você acender uma tocha na floresta, verá todas essas estruturas e terá dificuldade em visualizar animais ou plantas específicos. Suponha que você esteja interessado apenas em ver arbustos de mirtilo na floresta. Para fazer isso, você treina o vaga-lume para ser atraído apenas pelos arbustos de mirtilo, de modo que, quando você olha para a floresta, apenas os arbustos de mirtilo se iluminem. Você poderia dizer que usa vaga-lumes para marcar arbustos de mirtilo para poder ver estruturas de mirtilo na floresta.
Nesta analogia, a floresta representa a amostra inteira, os arbustos de mirtilo representam as estruturas que você deseja visualizar (por exemplo, células específicas ou organelas subcelulares) e os vaga-lumes são compostos fluorescentes. Iluminar a tocha sozinha, sem os vaga-lumes, é semelhante à microscopia de campo claro.
O próximo passo é compreender a função básica dos compostos fluorescentes (também conhecidos como fluoróforos). Os fluoróforos são, na verdade, pequenos objetos (nanoescala) projetados para conectar estruturas específicas em uma amostra. Eles absorvem uma faixa estreita de comprimentos de onda de luz e reemitem outro comprimento de onda de luz. Por exemplo, um fluoróforo pode absorver luz azul (ou seja, o fluoróforo é excitado pela luz azul) e depois reemitir luz verde. Isso geralmente é resumido pelos espectros de excitação e emissão (acima). Esses diagramas mostram o comprimento de onda da luz absorvida pelo fluoróforo e o comprimento de onda da luz emitida pelo fluoróforo.
O design do microscópio é muito semelhante ao de um microscópio de campo claro normal, com duas diferenças principais. Em primeiro lugar, a luz que ilumina a amostra deve estar no comprimento de onda que excita o fluoróforo (no exemplo acima, a luz é azul). Em segundo lugar, o microscópio só precisa coletar a luz emitida (luz verde) enquanto bloqueia a luz azul. Isso ocorre porque a luz azul está em toda parte, mas a luz verde só vem de estruturas específicas da amostra. Para bloquear a luz azul, os microscópios geralmente têm algo chamado filtro de passagem longa, que permite a passagem da luz verde sem a luz azul. Cada filtro passa-longa possui um comprimento de onda de corte. Se a luz tiver um comprimento de onda maior que o comprimento de onda de corte, ela poderá passar pelo filtro. Daí o nome “passe longo”. Comprimentos de onda mais curtos são bloqueados.
Etapa 2: Modelagem do microscópio com óptica óptica
Esta é uma etapa adicional aos princípios básicos do projeto de microscópios. Não há necessidade de construir um microscópio de fluorescência, então você pode ignorá-lo se não quiser se aprofundar em óptica.
Os microscópios de campo claro e de fluorescência podem ser modelados usando óptica de raios. A premissa básica da óptica de raios é que a luz se comporta de forma semelhante à luz que se afasta de uma fonte de luz. Quando você olha ao redor de uma sala, você vê a luz do sol fora de uma janela ou de uma lâmpada. A luz é então absorvida ou refletida pelos objetos na sala. Parte da luz refletida faz com que ela seja direcionada para os olhos. Se o objeto estiver iluminado, você pode imaginar cada ponto do objeto emitindo luz em todas as direções (acima). A lente, como a lente dos nossos olhos, foca a luz em um ponto para que possamos ver o objeto. Sem lente, a luz continua a viajar para fora e não forma uma imagem.
Então, como fazemos sistemas ópticos que ampliam pequenos objetos? Para entender o design, você realmente só precisa conhecer duas equações: a imagem de lente fina e as equações de ampliação:
1/F=1/SI + 1/SO
M=-si/so
f é a distância focal da lente. Uma distância focal mais curta significa que a lente tem mais poder de foco.
O mesmo se aplica à distância do objeto; a distância entre a lente e o objeto (por exemplo, uma árvore).
si é a distância da imagem; a distância entre a lente e onde a imagem é formada
M é ampliação; quão grande é a imagem em relação ao objeto. Para microscópios, queremos aumentar a ampliação.
Para um tutorial completo sobre a equação de lentes finas, confira este vídeo da Khan Academia. No gif acima, você pode ver que a distância que o objeto se aproxima da lente aumenta a distância da imagem, o que aumenta a ampliação. A linha vertical com duas setas indica a lente.
