Vantagens aprimoradas dos microscópios multifotônicos de varredura a laser
O microscópio multifotônico de varredura a laser é uma melhoria significativa da microscopia óptica, manifestada principalmente na capacidade de observar estruturas profundas de células vivas, células fixas e tecidos, e obter estruturas planas multi-camadas Z- claras e nítidas, ou seja, fatias ópticas, que podem ser usadas para construir estruturas sólidas tri-dimensionais de espécimes. O microscópio confocal usa uma fonte de luz laser, que é expandida para preencher todo o plano focal da lente objetiva e depois convergida em pontos muito pequenos no plano focal da amostra através do sistema de lentes da lente objetiva. De acordo com a abertura numérica da lente objetiva, o diâmetro do ponto de iluminação mais brilhante é de cerca de 0,25-0,8 μm e a profundidade é de cerca de 0,5-1,5 μm. O tamanho do ponto confocal é determinado pelo design do microscópio, comprimento de onda do laser, características objetivas, configurações de estado da unidade de digitalização e propriedades da amostra. A faixa de iluminação e a profundidade de um microscópio de campo são grandes, enquanto a iluminação de um microscópio confocal é focada em um ponto focal no plano focal. A vantagem básica da microscopia confocal é que ela pode realizar cortes ópticos finos em amostras fluorescentes espessas (até 50 μm ou mais), com espessura de aproximadamente 0,5 a 1,5 μm. A série de imagens de fatias ópticas pode ser obtida movendo a amostra para cima e para baixo usando o motor de passo do eixo Z-do microscópio. A coleta de informações da imagem é controlada dentro do plano * *, sem interferência de sinais emitidos de outras posições da amostra. Depois de remover a influência da fluorescência de fundo e aumentar a relação sinal-ruído, o contraste e a resolução das imagens confocal são significativamente melhorados em comparação com as imagens tradicionais de fluorescência de iluminação de campo. Em muitas amostras, componentes estruturais intrincados se entrelaçam para formar sistemas complexos, mas uma vez coletadas seções ópticas suficientes, podemos usar software para reconstruí-las em três dimensões. Este método experimental tem sido amplamente utilizado em pesquisas biológicas para elucidar as complexas relações estruturais e funcionais entre células ou tecidos.
