Como a morfologia das células microbianas é observada ao microscópio?
Os microscópios foram inventados para ver objetos sorridentes que não podem ser vistos a olho nu. Os microrganismos são muito pequenos, por isso devem ser ampliados e observados com a ajuda de um microscópio. Além disso, existem muitos tipos de microrganismos, portanto, basicamente, a maioria dos microscópios ópticos pode observar microrganismos. A próxima questão é que tipo de microscópio deve ser usado para observação e análise de que tipo de microorganismos. Microscópios comuns que podem ser usados para observar a morfologia microbiana incluem microscópios biológicos, microscópios de contraste de fase, microscópios invertidos, microscópios de fluorescência, microscópios confocal, etc.
A seguir descrevemos os vários microscópios usados para observar microrganismos:
1. O microscópio óptico comum usa luz natural ou luz como fonte de luz e seu comprimento de onda é de cerca de 0,4 μm. A resolução do microscópio é metade do comprimento de onda, ou seja, 0,2 μm, e a menor imagem visível a olho nu é 0,2 mm. Portanto, usar um espelho de óleo (imersão) para ampliar 1000 vezes pode ampliar as partículas de 0,2 μm em 0,2 mm visíveis a olho nu. Microscópios ópticos comuns podem ser usados para a observação de bactérias, actinomicetos e fungos.
2. A microscopia de campo escuro é comumente usada para observar a morfologia e o movimento microbiano sem coloração. Depois que o condensador de campo escuro é instalado no microscópio comum, a luz não consegue penetrar diretamente do meio e o campo de visão fica escuro. Quando a amostra recebe luz oblíqua da borda do condensador, ela pode ser espalhada, de modo que microrganismos brilhantes, como bactérias ou espiroquetas, podem ser observados no fundo escuro do campo.
3. Microscópio de contraste de fase O microscópio de contraste de fase usa o efeito de luz da placa de diferença de fase para alterar a fase de luz e a amplitude da luz direta e converter a diferença de fase de luz em diferença de intensidade de luz. Sob um microscópio de contraste de fase, quando a luz passa através de uma amostra não corada, a diferença na fase da luz é causada pela inconsistência da densidade das diferentes partes da amostra, e a morfologia, a estrutura interna e o modo de movimento dos microrganismos podem ser observados.
4. Microscópio de fluorescência O microscópio de fluorescência é basicamente igual ao microscópio óptico comum, a principal diferença é a fonte de luz, filtro e condensador. Atualmente, a maioria deles usa dispositivos epi-light, e lâmpadas de mercúrio de alta pressão são comumente usadas como fontes de luz, que podem emitir luz ultravioleta ou azul-violeta. Existem dois tipos de filtros: filtro de excitação e filtro de absorção. Além dos condensadores gerais de campo claro, os condensadores de campo escuro também podem ser usados em microscópios de fluorescência usando luz azul para aumentar o contraste entre a fluorescência e o fundo. Este método é aplicável à detecção ou identificação de bactérias coradas com pigmentos fluorescentes ou combinadas com anticorpos fluorescentes.
5. Os microscópios eletrônicos usam o fluxo de elétrons como fonte de luz, e o comprimento de onda é dezenas de milhares de vezes diferente da luz visível, o que melhora muito a resolução. Ele também usa uma bobina magnética como sistema de amplificação óptica, e a ampliação pode chegar a dezenas de milhares ou centenas de milhares de vezes. É frequentemente usado para observação de partículas virais e ultraestrutura bacteriana.
Observação de amostras microbianas não coradas:
Amostras não coradas geralmente podem ser usadas para observar a morfologia, força e movimento bacteriano. As bactérias são incolores e transparentes quando não coradas e são observadas ao microscópio principalmente pela diferença entre o índice de refração da bactéria e o ambiente circundante. As bactérias com flagelos movem-se vigorosamente, enquanto as bactérias sem flagelos apresentam movimento browniano irregular. Bactérias viáveis, como Treponema pallidum, Leptospira e Campylobacter, têm formas e padrões de movimento distintos, que são de importância diagnóstica. Os métodos comumente usados são o método de queda de pressão, o método de queda pendente e o método capilar.
1. Aplique vaselina ao redor do orifício côncavo do vidro côncavo limpo pelo método de gota suspensa, use um laço de inoculação para pegar um anel de suspensão bacteriana e coloque-o no centro da tampa de vidro e, em seguida, alinhe o orifício côncavo do vidro côncavo com a gota no centro da lamela e cubra-a, em seguida, vire-a rapidamente, pressione levemente a lamela para fazê-la aderir firmemente à vaselina na borda do orifício côncavo e observe sob um microscópio de alta ampliação (ou campo escuro).
2. Pegue um anel de suspensão bacteriana com uma alça de inoculação e coloque-o no centro de uma lâmina de vidro limpa pelo método de queda de pressão e cubra suavemente a suspensão bacteriana com uma lamela de vidro, tomando cuidado para evitar bolhas e transbordamento da suspensão bacteriana. . Depois de ficar parado por alguns segundos, observe sob um microscópio de alta potência em campo claro (ou campo escuro).
3. O método capilar é usado principalmente para o exame da cinética de bactérias anaeróbias. Geralmente escolha 60~70mm de comprimento. Depois de sifonar a suspensão de bactérias anaeróbias através de um capilar com abertura de 0,5-1,0 mm, sele as duas extremidades do capilar com uma chama. O capilar foi fixado na lâmina de vidro com papel plástico e observado sob lente de grande aumento em campo escuro.
Observação de amostras microbianas coradas com um microscópio:
Depois que a amostra bacteriana é corada, devido ao nítido contraste de cor entre as bactérias e o ambiente circundante, as características morfológicas das bactérias (como tamanho, forma, disposição, etc.) das bactérias e algumas estruturas especiais (como como cápsulas, flagelos, esporos, etc.) podem ser claramente observados sob um microscópio óptico comum, e as bactérias podem ser classificadas e identificadas de acordo com a reatividade da coloração.
(1) Procedimento geral de coloração bacteriana O procedimento geral de coloração bacteriana é: esfregaço (secagem) - fixação - coloração.
1. Preparação de esfregaço de sangue, secreções, excreções, fluido de punção e cultura líquida e esfregaços diretos de filme fino em lâminas de vidro; autópsia ou tecidos de animais infectados, esfregar a lesão com um cotonete para amostragem. Para a preparação de colônias bacterianas ou gramados em meio sólido, primeiro use uma alça de inoculação para pegar um anel de solução salina normal e coloque-o no centro da lâmina de vidro, depois use uma alça de inoculação estéril para pegar uma pequena quantidade de cultura e triturar uniformemente em solução salina normal, espalhe sobre uma superfície revestida de 1cm2 e deixe secar naturalmente em temperatura ambiente ou secar lentamente à distância.
2. O objetivo da fixação é matar bactérias, coagular proteínas e estruturas bacterianas e facilitar a coloração; promover a adesão de bactérias à lâmina para evitar serem lavadas pela água durante a lavagem; alterar a permeabilidade das bactérias aos corantes, o que é benéfico para a coloração das estruturas intracelulares bacterianas. Geralmente é fixado por aquecimento com chama, e a mancha seca passa rapidamente pela chama 3 vezes. É melhor não queimar a pele do dorso da mão ao tocar a lâmina.
3. Tingimento De acordo com diferentes fins de inspeção, escolha diferentes métodos de tingimento para tingir. Ao tingir, adicione a solução corante gota a gota para aumentar a cobertura.
4. Mordente Qualquer substância que possa aumentar a afinidade entre o corante e o objeto tingido, fixar o corante no objeto tingido e causar uma alteração na permeabilidade da membrana celular é chamada de mordente. Comumente usados são alúmen, ácido tânico, sais metálicos e iodo, etc., e o aquecimento também é usado para promover a coloração. Os mordentes podem ser usados entre a coloração primária e a contracoloração, e também podem ser usados após a fixação ou contidos no fixador e na coloração.
5. Descoloração Qualquer agente químico capaz de remover a cor do objeto tingido é chamado de descolorante. Etanol, acetona, etc. são comumente usados como descolorantes. O agente descolorante pode detectar o grau de estabilidade da combinação de bactérias e corantes, que pode ser utilizado para coloração diferencial.
6. Contracoloração As bactérias ou as suas estruturas que foram descoloradas são frequentemente contrastadas com uma solução de contracoloração para facilitar a observação. A cor da solução de contracoloração é diferente daquela da solução de tingimento primário para formar um contraste nítido. A contracoloração não deve ser muito forte, para não encobrir a cor da coloração inicial.
