Como a microscopia de fluorescência difere da microscopia convencional
Recentemente tentei fazer algumas seções congeladas de camundongos e agora preciso usar um microscópio de fluorescência para ver se o vírus que injetei está na área cerebral desejada. Alguns princípios básicos da microscopia de fluorescência precisam ser estudados brevemente e também os compartilharei aqui.
O microscópio de fluorescência usa luz ultravioleta como fonte de luz para iluminar o objeto que está sendo testado, fazendo com que o objeto emita uma fonte de luz e, em seguida, observe o objeto sob o microscópio. Utilizado principalmente para células de imunofluorescência, é composto por fonte de luz, sistema de placa filtrante e sistema óptico para observar a imagem de fluorescência da amostra através da ampliação da ocular e lente objetiva. Vamos dar uma olhada na diferença entre este microscópio de fluorescência e um microscópio óptico normal.
1. Em termos de métodos de iluminação
O método de iluminação de um microscópio de fluorescência geralmente usa um método de feixe descendente, o que significa que a fonte de luz é projetada na amostra de teste através da lente objetiva.
2. Em termos de resolução
A microscopia de fluorescência usa luz ultravioleta como fonte de luz, com comprimento de onda relativamente curto, mas resolução mais alta do que os microscópios ópticos comuns.
3. Diferenças no filtro
Um microscópio de fluorescência usa dois filtros especiais, um na frente da fonte de luz para filtrar a luz visível e outro entre a objetiva e a ocular para filtrar a luz ultravioleta, que pode proteger os olhos.
A microscopia de fluorescência também é um tipo de microscópio óptico, principalmente porque o comprimento de onda excitado pela microscopia de fluorescência é curto, o que leva a diferenças na estrutura e no uso da microscopia de fluorescência e da microscopia comum. A maioria dos microscópios de fluorescência tem uma boa função de capturar luz fraca, portanto sua capacidade de geração de imagens também é boa sob fluorescência extremamente fraca. Além disso, com a melhoria contínua da microscopia de fluorescência nos últimos anos, o ruído também foi significativamente reduzido. Portanto, cada vez mais microscópios de fluorescência estão sendo aplicados.
Conhecimento relacionado à microscopia de fluorescência de dois fótons
O princípio básico da excitação de dois fótons é que, em alta densidade de fótons, as moléculas fluorescentes podem absorver simultaneamente dois fótons de comprimento de onda longo e, após um curto período do chamado estado de vida excitado, emitir um fóton de comprimento de onda mais curto; Seu efeito é o mesmo que usar um fóton com comprimento de onda igual à metade do comprimento de onda longo para excitar moléculas fluorescentes. A excitação de dois fótons requer uma alta densidade de fótons e, para evitar danos às células, um laser de pulso bloqueado no modo de alta energia é usado em um microscópio de dois fótons. O laser emitido por esse tipo de laser possui alta energia de pico e baixa energia média, com largura de pulso de apenas 100 femtossegundos e frequência de até 80 a 100 megahertz. Ao usar uma objetiva de alta abertura numérica para focar os fótons de um laser pulsado, a densidade de fótons no ponto focal da objetiva é a mais alta e a excitação de dois fótons ocorre apenas no ponto focal da objetiva. Portanto, um microscópio de dois fótons não requer furos confocais, o que melhora a eficiência da detecção de fluorescência.
Em fenômenos gerais de fluorescência, devido à baixa densidade de excitação de fótons, uma molécula fluorescente pode absorver apenas um fóton por vez e, em seguida, emitir um fóton fluorescente por meio da transição de radiação, que é chamada de fluorescência de fóton único. Para o processo de excitação de fluorescência usando laser como fonte de luz, podem ocorrer fenômenos de fluorescência de dois fótons ou mesmo multifótons. Neste momento, a fonte de luz de excitação utilizada é de alta intensidade e a densidade de fótons atende ao requisito para que as moléculas fluorescentes absorvam dois fótons simultaneamente. No processo de utilização de um laser típico como fonte de luz de excitação, a densidade de fótons ainda não é suficiente para gerar o fenômeno de absorção de dois fótons. Normalmente, são usados lasers de pulso de femtossegundos e sua potência instantânea pode atingir o nível de megawatts. Portanto, o comprimento de onda da fluorescência de dois fótons é mais curto que o da excitação, o que é equivalente ao efeito produzido pela excitação do comprimento de onda de excitação de meio comprimento.
