Parâmetros Técnicos de Microscopia de Fluorescência Técnicas e Métodos de Microscopia de Fluorescência
Parâmetros técnicos do microscópio de fluorescência 1. Ocular grande angular 2. Lente objetiva acromática 3. Conversor de lente objetiva de quatro orifícios 4. Dispositivo epifluorescente Sistema de excitação azul (B) Verde (G) 10Lâmpada de mercúrio 0W 5. Mecanismo de ajuste de foco grosso e fino coaxial: ajuste Faixa de foco: 15 mm Valor da grade de micromovimento: 0,002 mm 6. Mesa mecânica de camada dupla Faixa de movimento longitudinal: 70 mm Faixa de movimento lateral: 50 mm
Parâmetros técnicos do microscópio de fluorescência
1. Ocular grande angular
2. Lente objetiva acromática
3. Revólver de quatro aberturas
4. Dispositivo de epifluorescência azul (B) sistema de excitação verde (G) lâmpada de mercúrio de 100W
5. Mecanismo de ajuste de foco grosso e fino coaxial: faixa de foco 15 mm valor da grade de movimento fino 0,002 mm
6. Bancada mecânica de camada dupla
Faixa de movimento vertical: 70 mm Faixa de movimento lateral: 50 mm
Habilidades e métodos de microscopia de fluorescência
(1) Lâmina de vidro
A espessura da lâmina de vidro deve estar entre 0,8 e 1,2 mm. Por um lado, uma lâmina muito espessa absorverá mais luz e, por outro lado, a luz de excitação não poderá ser concentrada na amostra. As lâminas devem ser lisas, uniformes em espessura e livres de autofluorescência óbvia. Às vezes, lâminas de vidro de quartzo são usadas.
(2) Cobertura de vidro
A espessura da tampa de vidro é de cerca de 0,17 mm, lisa. Para fortalecer a luz de excitação, também pode ser usado um vidro de cobertura de interferência, que é um vidro de cobertura especial revestido com várias camadas de substâncias (como fluoreto de magnésio) que têm diferentes efeitos de interferência na luz de diferentes comprimentos de onda, o que pode tornar o fluorescência ir sem problemas. A luz excitante é atravessada e refletida, e esta luz de excitação refletida excita o espécime.
(3) Amostra
Fatias de tecido ou outras amostras não devem ser muito grossas. Se for muito espesso, a maior parte da luz de excitação será consumida na parte inferior da amostra, enquanto a parte superior observada diretamente pela lente objetiva não será totalmente excitada. Além disso, a sobreposição de células ou a cobertura de impurezas afetam o julgamento.
(4) Agente de montagem
A glicerina é comumente usada como agente de montagem, que não deve ter autofluorescência, incolor e transparente, e o brilho da fluorescência é mais brilhante em pH 8.5-9.5, e não é fácil desbotar rapidamente. Portanto, uma mistura igual de glicerol e solução tampão de carbonato 0.5mol/l com um pH de 9.0 a 9,5 é comumente usada como agente de montagem.
(5) óleo de espelho
Geralmente, ao observar amostras com microscópios de fluorescência de campo escuro e lentes de imersão em óleo, deve-se usar óleo de imersão. É melhor usar óleo de imersão especial não fluorescente. A glicerina acima também pode ser usada, e a parafina líquida também pode ser usada, mas o índice de refração é baixo, o que tem um leve impacto na qualidade da imagem. Influência.
O princípio e as características estruturais do microscópio de fluorescência
A microscopia de fluorescência usa um ponto com alta eficiência luminosa para emitir luz de um determinado comprimento de onda (como luz ultravioleta 3650 pol. ou luz azul púrpura 4200 pol.) várias cores Depois disso, observe através da ampliação da lente objetiva e ocular. Desta forma, sob um fundo de forte contraste, mesmo que a fluorescência seja muito fraca, é fácil de identificar e possui alta sensibilidade. É usado principalmente para a pesquisa de estrutura e função celular e composição química. A estrutura básica de um microscópio de fluorescência é composta por um microscópio óptico comum mais alguns acessórios (como uma fonte de luz fluorescente, um filtro de excitação, um divisor de feixe de duas cores e um filtro de bloqueio, etc.). Fonte de luz fluorescente—geralmente usa lâmpada de mercúrio de pressão ultra-alta (50-200W), que pode emitir luz de vários comprimentos de onda, mas cada substância fluorescente tem um comprimento de onda de excitação que produz a fluorescência mais forte, então um filtro de excitação ( Geralmente, existem filtros de excitação ultravioleta, roxo, azul e verde), que permitem apenas que a luz de excitação de um determinado comprimento de onda passe e irradie a amostra, enquanto absorve outra luz. Depois que cada substância é irradiada pela luz de excitação, ela emite fluorescência visível com um comprimento de onda maior que o comprimento de onda de irradiação em um tempo muito curto. A fluorescência é específica e geralmente mais fraca que a luz de excitação. Para observar a fluorescência específica, o bloqueio (ou supressão) deve ser adicionado atrás da lente objetiva e usado em conjunto com ela.
A diferença entre o microscópio de fluorescência e o microscópio comum
1. O método de iluminação geralmente é episcópico, ou seja, a fonte de luz é projetada na amostra através da lente objetiva;
2. A fonte de luz é a luz ultravioleta, o comprimento de onda é mais curto e a resolução é maior do que a dos microscópios comuns;
3. Existem dois filtros especiais, aquele na frente da fonte de luz é usado para filtrar a luz visível, e aquele entre a ocular e a lente objetiva é usado para filtrar os raios ultravioleta para proteger o olho humano.
O microscópio de fluorescência também é um tipo de microscópio óptico, a principal diferença é que o comprimento de onda de excitação dos dois é diferente. Isso determina a diferença entre o microscópio de fluorescência e o microscópio óptico comum em termos de estrutura e uso.
A microscopia de fluorescência é uma ferramenta essencial na citoquímica de imunofluorescência. É composto de componentes principais, como fonte de luz, sistema de placa de filtro e sistema óptico. É usar um certo comprimento de onda de luz para excitar o espécime para emitir fluorescência e observar a imagem de fluorescência do espécime amplificando a lente objetiva e o sistema ocular.
