Método de detecção por microscopia de fluorescência
microscópio de fluorescência
A microscopia de fluorescência é uma ferramenta fundamental para a citoquímica de imunofluorescência. É composto de componentes principais, como fonte de luz, sistema de placa de filtro e sistema óptico. Ele usa um determinado comprimento de onda de luz para excitar a amostra e emitir fluorescência, que é ampliada através de uma objetiva e sistema ocular para observar a imagem de fluorescência da amostra (Figura 1).
(1) Fonte de luz
Hoje em dia, uma lâmpada de mercúrio de ultra-alta pressão de 200 W é comumente usada como fonte de luz. É feito de vidro de quartzo, com formato esférico no meio e uma certa quantidade de mercúrio preenchido em seu interior. Durante a operação, a descarga entre os dois eletrodos faz com que o mercúrio evapore e a pressão dentro da esfera aumente rapidamente. Quando o mercúrio evapora completamente, ele pode atingir 50-70 pressões atmosféricas padrão, o que geralmente leva cerca de 5-15 minutos. A luminescência das lâmpadas de mercúrio de ultra-alta pressão é o resultado da descarga entre os eletrodos, que se dissocia e reduz continuamente as moléculas de mercúrio e emite fótons. Emite forte luz ultravioleta e azul violeta, suficiente para excitar diversas substâncias fluorescentes, portanto, é amplamente utilizado em microscópios de fluorescência.
Precauções ao usar um microscópio de fluorescência
(1) Siga rigorosamente as instruções da fábrica do microscópio de fluorescência e não altere o programa arbitrariamente.
(2) A inspeção deve ser realizada em uma sala escura. Após entrar na câmara escura, conecte a alimentação e acenda a lâmpada de mercúrio de ultra-alta pressão por 5-15 minutos. Depois que a fonte de luz emitir luz forte e se estabilizar, os olhos deverão se adaptar totalmente à câmara escura antes de começar a observar a amostra.
(3) Para evitar danos UV aos olhos, óculos de proteção devem ser usados ao ajustar a fonte de luz.
(4) O tempo de inspeção deve ser de 1-2 horas de cada vez. Se exceder 90 minutos, a intensidade luminosa da lâmpada de mercúrio de ultra-alta pressão diminui gradualmente e a fluorescência enfraquece; Amostras expostas à radiação ultravioleta por 3-5 dias
Após um minuto, a fluorescência também diminuiu significativamente; Portanto, a duração máxima não deve exceder 2-3 horas.
(5) A vida útil da fonte de luz do microscópio fluorescente é limitada e a amostra deve ser examinada centralmente para economizar tempo
Economize tempo e proteja a fonte de luz. Quando o tempo está quente, um ventilador elétrico deve ser adicionado para dissipar o calor e esfriar. Ao substituir uma lâmpada nova, o tempo de uso deve ser registrado desde o início. Quando a luz estiver apagada e você quiser utilizá-la novamente, deverá esperar que a lâmpada esfrie o suficiente antes de acendê-la. Evite acender a fonte de luz várias vezes ao dia.
(6) Observe a amostra imediatamente após a coloração, pois a fluorescência enfraquecerá gradualmente com o tempo. Se a amostra for armazenada em um saco plástico de polietileno a 4 graus, isso pode atrasar o tempo de atenuação da fluorescência e evitar a evaporação do agente de montagem.
(7) Os critérios de julgamento para o brilho da fluorescência são geralmente divididos em quatro níveis, nomeadamente "um" - nenhuma fluorescência ou fluorescência fraca visível. "+" - Apenas a fluorescência visível é visível. ++- Visível com fluorescência brilhante. "+++" - Fluorescência visível e deslumbrante.
