Os microscópios de fluorescência podem ser divididos em dois tipos de acordo com o princípio do caminho óptico:
1. Microscópio de fluorescência de transmissão
Os microscópios de fluorescência mais antigos usam um holofote para excitar a fluorescência passando a fonte de luz de excitação através do material da amostra. Sua vantagem é a forte fluorescência com baixa ampliação, mas sua desvantagem é que sua fluorescência diminui com a crescente ampliação. Portanto, é adequado apenas para observar materiais maiores de amostra.
2. Microscópio de fluorescência leve em queda
A luz de excitação cai da lente objetiva na superfície da amostra, usando a mesma lente objetiva que o condensador de iluminação e a lente objetiva para coletar fluorescência.
Um divisor de feixe de cores duplo (espelho dicroico) precisa ser adicionado ao caminho óptico, que forma um ângulo de 45 graus com o eixo óptico. A luz de excitação é refletida na lente objetiva e focada na amostra. A fluorescência gerada pela amostra, bem como a luz de excitação refletida na superfície da lente objetiva e tampa o vidro, entra na lente objetiva ao mesmo tempo e retorne ao divisor de feixe de cores duplo para separar a luz de excitação e a fluorescência. A luz de excitação residual é então bloqueada pela absorção do filtro. Se diferentes combinações de filtros de excitação, separadores de feixe de cores duplos e filtros de bloqueio forem usados, eles podem atender às necessidades de diferentes produtos de reação fluorescente.
As vantagens deste microscópio de fluorescência são iluminação de campo uniforme, imagem clara e fluorescência mais forte com maior ampliação.
3. Microscópio de contraste de fase
O microscópio de contraste de fase é um microscópio que pode converter a diferença de fase (ou diferença de caminho óptico) gerado quando a luz passa através de um objeto em amplitude (intensidade da luz) muda. Usado principalmente para observar células vivas, seções de tecido não coradas ou amostras coradas sem contraste.
O olho humano só pode distinguir mudanças no comprimento de onda (cor) e amplitude da luz visível, mas não pode distinguir mudanças na fase. A maioria das amostras biológicas é altamente transparente, e a amplitude das ondas leves permanece basicamente inalterada após a passagem, com apenas mudanças de fase.
O microscópio de contraste de fase converte basicamente a diferença de caminho óptico da luz visível que passa através da amostra em diferença de amplitude, melhorando assim o contraste entre várias estruturas e tornando -as claras e visíveis. Depois de passar pela amostra, a luz passa por refração, desviando -se do caminho óptico original e atrasado em 1/4 λ (comprimento de onda). Se a diferença do caminho óptico for aumentado ou diminuído em outro 1/4 λ, a diferença do caminho óptico se tornará 1/2 λ, e a interferência entre os dois feixes de luz aumenta ou diminui após a combinação do eixo, melhorando o contraste.
