Características e Aplicações da Microscopia Confocal a Laser
O microscópio confocal de varredura a laser (LSCM) é um tipo de microscópio projetado com base na tecnologia de foco conjugado, ou seja, para fazer a fonte de luz laser, a amostra em teste e o detector na posição conjugada um do outro.
Fundamental
Em microscópios gerais, o plano focal da lente objetiva coincide com o detector de forma que o plano da imagem observada é isolado do plano axial adjacente, enquanto em microscópios confocais, a amostra é iluminada usando um ponto de luz limitado por difração, e no microscópio Este efeito de isolamento é obtido usando um orifício no caminho da luz de coleta no ponto focal do conjugado de ponto para filtrar a luz difusa para melhorar a resolução.
Recursos de imagem
Somente a luz refletida da camada de amostra conjugada pode passar pelo pequeno orifício no caminho da luz de coleta, e os reflexos irrelevantes restantes da camada de amostra são bloqueados pelo pequeno orifício. Isso pode resultar em um aumento significativo na resolução. Abaixo é mostrada uma comparação lado a lado da microscopia de fluorescência multidimensional e da microscopia confocal da mesma amostra espessa. Quando uma série de imagens é tirada em diferentes planos focais, o que é comumente chamado de "z-stack" pode ser gerado, e esta imagem mostra os ganhos de resolução e contraste oferecidos pela microscopia confocal e as causas subjacentes desses ganhos. Examinar a imagem no topo da pilha com o plano de imagem acima do tecido revela muita luz dispersa na imagem de fluorescência, enquanto a imagem confocal aparece preta. Essa redução do PSF na direção axial é diretamente responsável pela diferença de resolução observada na interface óptica no meio do z-stack.
Outra característica da microscopia confocal de varredura a laser é que ela é uma tecnologia de imagem de varredura. A tecnologia tradicional de iluminação de campo amplo ilumina toda a amostra, de modo que a imagem pode ser capturada diretamente a olho nu ou por um detector, mas o LSCM usa um feixe ou vários feixes focados passam pela amostra para digitalização e geração de imagens, e a imagem resultante é chamado seção óptica. O seguinte mostra a diferença entre o método tradicional de iluminação de campo amplo e o método de iluminação confocal de varredura a laser.
Portanto, um método de trabalho prático de um microscópio confocal moderno é mostrado na figura abaixo. A luz de excitação emitida pelo laser passa por um espelho dicróico e varre nas direções x e y da amostra através de um par de espelhos vibratórios. A excitação (ou reflexão) da amostra A luz entra no detector PMT através do orifício e é registrada, e a imagem de varredura gravada é reconstruída pelo computador para obter a imagem real da amostra.
