Aprimorando os benefícios da microscopia multifotônica de varredura a laser
A microscopia multifotônica de varredura a laser é uma grande melhoria em relação à microscopia óptica. Ele pode observar a estrutura profunda de células vivas, células fixas e tecidos, e pode obter estruturas de plano Z multicamadas claras e nítidas, ou seja, seções ópticas, a partir das quais pode construir a estrutura sólida tridimensional da amostra. A microscopia confocal usa uma fonte de luz laser que, após expansão, preenche todo o plano focal posterior da lente objetiva e, em seguida, passa pelo sistema de lentes da lente objetiva para convergir para um ponto muito pequeno no plano focal da amostra. Dependendo da abertura numérica da lente objetiva, o diâmetro do ponto de iluminação mais brilhante é de cerca de 0,25 ~ 0,8μm, e a profundidade é de cerca de 0,5 ~ 1,5μm . O tamanho do ponto confocal depende do design do microscópio, do comprimento de onda do laser, das características da lente objetiva, das configurações de status da unidade de digitalização e das propriedades da amostra. A microscopia de campo possui uma grande faixa e profundidade de iluminação, enquanto a microscopia confocal possui uma iluminação focada em um ponto focal no plano focal. A vantagem mais básica da microscopia confocal é que ela pode realizar cortes ópticos finos de amostras fluorescentes espessas (que podem atingir 50 μm ou mais), e a espessura das seções é de cerca de 0,5 a 1,5 μm. Uma série de imagens de seção óptica pode ser obtida movendo a amostra para cima e para baixo usando o motor de passo do eixo Z do microscópio. A aquisição de informações de imagem é controlada dentro do plano e não sofrerá interferência de sinais emitidos de outros locais da amostra. Depois de remover a influência da fluorescência de fundo e aumentar a relação sinal-ruído, o contraste e a resolução das imagens confocal são significativamente melhorados em comparação com as imagens tradicionais de fluorescência iluminadas em campo. Em muitas amostras, muitos componentes estruturais intrincados estão interligados para formar sistemas complexos, mas uma vez coletadas seções ópticas suficientes, podemos reconstruí-las em três dimensões através de software. Este método experimental tem sido amplamente utilizado em pesquisas biológicas para elucidar as complexas relações estruturais e funcionais entre células ou tecidos.
