Diferença entre microscópio comum e microscópio de fluorescência
Os microscópios de fluorescência usam luz ultravioleta como fonte de luz para irradiar o objeto a ser inspecionado, de modo que o objeto emita luz e, em seguida, observe o objeto sob o microscópio. É usado principalmente para células de imunofluorescência. É composto principalmente por uma fonte de luz, um sistema de placa de filtro e um sistema óptico para observar a imagem fluorescente da amostra através da ampliação da ocular e da lente objetiva. Vamos dar uma olhada na diferença entre este microscópio de fluorescência e um microscópio óptico comum.
1. Em termos de métodos de iluminação
O método de iluminação do microscópio de fluorescência é geralmente episcópico, ou seja, a fonte de luz é projetada na amostra de teste através da lente objetiva.
2. Em termos de resolução
Os microscópios de fluorescência usam luz ultravioleta como fonte de luz. O comprimento de onda é relativamente curto, mas a resolução é maior do que a dos microscópios ópticos comuns.
3. A diferença no filtro
O microscópio de fluorescência usa dois filtros especiais, que são usados na frente da fonte de luz para filtrar a luz visível e usados entre a lente objetiva e a ocular para filtrar a luz ultravioleta, que pode proteger os olhos humanos.
O microscópio de fluorescência também é um tipo de microscópio óptico, principalmente porque o comprimento de onda excitado pelo microscópio de fluorescência é curto, o que leva à diferença de estrutura e uso entre o microscópio de fluorescência e o microscópio comum. A maioria dos microscópios de fluorescência tem uma boa função de capturar luz fraca, portanto, sob fluorescência extremamente fraca, sua capacidade de imagem também é boa. Juntamente com a melhoria contínua dos microscópios de fluorescência nos últimos anos, o ruído também foi bastante reduzido. Portanto, cada vez mais microscópios de fluorescência são usados.
Conhecimento sobre microscopia de fluorescência de dois fótons
O princípio básico da excitação de dois fótons é: no caso de alta densidade de fótons, as moléculas fluorescentes podem absorver dois fótons de comprimento de onda longo ao mesmo tempo e emitir um fóton de comprimento de onda mais curto após um curto período do chamado tempo de vida do estado excitado . ; o efeito é o mesmo que usar um fóton cujo comprimento de onda é metade do comprimento de onda longo para excitar uma molécula fluorescente. A excitação de dois fótons requer uma alta densidade de fótons. Para não danificar as células, a microscopia de dois fótons usa lasers pulsados de modo bloqueado de alta energia. O laser emitido por este laser possui alta energia de pico e baixa energia média, sua largura de pulso é de apenas 100 femtossegundos e sua frequência pode chegar a 80 a 100 megahertz. Ao usar uma lente objetiva de alta abertura numérica para focar os fótons do laser pulsado, a densidade de fótons no ponto focal da lente objetiva é a mais alta e a excitação de dois fótons ocorre apenas no ponto focal da lente objetiva, então o microscópio de dois fótons não precisa de um orifício confocal, o que melhora a eficiência da detecção de fluorescência.
Em fenômenos gerais de fluorescência, devido à baixa densidade de fótons da luz de excitação, uma molécula fluorescente pode absorver apenas um fóton ao mesmo tempo e, em seguida, emitir um fóton fluorescente por meio de uma transição radiativa, que é a fluorescência de fóton único. Para o processo de excitação de fluorescência usando laser como fonte de luz, pode ocorrer fluorescência de dois fótons ou mesmo multifótons. Neste momento, a intensidade da fonte de luz de excitação usada é alta e a densidade de fótons atende aos requisitos de moléculas fluorescentes que absorvem dois fótons ao mesmo tempo. No processo de uso de um laser geral como fonte de luz de excitação, a densidade de fótons ainda não é suficiente para produzir o fenômeno de absorção de dois fótons. Normalmente, utiliza-se um laser pulsado de femtossegundos, cuja potência instantânea pode atingir a ordem de megawatts. Portanto, o comprimento de onda da fluorescência de dois fótons é menor do que o comprimento de onda da luz de excitação, que é equivalente ao efeito produzido pela excitação na metade do comprimento de onda de excitação.
A microscopia de fluorescência de dois fótons tem muitas vantagens:
1) A luz de comprimento de onda longo é menos afetada pela dispersão do que a luz de comprimento de onda curto e penetra facilmente na amostra;
2) As moléculas fluorescentes fora do plano focal não são excitadas, de modo que mais luz de excitação possa atingir o plano focal, de modo que a luz de excitação possa penetrar em espécimes mais profundos;
3) A luz infravermelha de comprimento de onda longo é menos tóxica para as células do que a luz de comprimento de onda curto;
4) Ao usar um microscópio de dois fótons para observar espécimes, o fotobranqueamento e a fototoxicidade ocorrem apenas no plano focal. Portanto, a microscopia de dois fótons é mais adequada do que a microscopia de fóton único para observar espécimes espessos, para observar células vivas ou para experimentos de fotobranqueamento de pontos.
Conhecimento sobre microscopia de fluorescência confocal
O princípio básico da microscopia de fluorescência confocal: uma fonte de luz pontual é usada para irradiar a amostra e um pequeno ponto de luz bem definido é formado no plano focal. composto por divisores. O divisor de feixe envia a fluorescência diretamente para o detector. Há um orifício na frente da fonte de luz e do detector, chamados respectivamente de orifício de iluminação e orifício de detecção. O tamanho geométrico dos dois é o mesmo, cerca de 100-200 nm; em relação ao ponto de luz no plano focal, os dois são conjugados, ou seja, o ponto de luz passa por uma série de lentes e, finalmente, pode ser focado no orifício de iluminação e no orifício de detecção ao mesmo tempo. Desta forma, a luz do plano focal pode convergir dentro do escopo do orifício de detecção, enquanto a luz espalhada de cima ou abaixo do plano focal é bloqueada fora do orifício de detecção e não pode ser visualizada. O laser varre a amostra ponto a ponto, e o tubo fotomultiplicador após detectar o pinhole também obtém a imagem confocal do ponto de luz correspondente ponto a ponto, que é convertido em um sinal digital e transmitido ao computador e, finalmente, agregado em um claro imagem confocal de todo o plano focal na tela.
Cada imagem do plano focal é, na verdade, uma seção transversal óptica do espécime. Essa seção transversal óptica sempre tem uma certa espessura, também conhecida como seção fina óptica. Como a intensidade da luz no ponto focal é muito maior do que no ponto sem foco, e a luz do plano não focal é filtrada pelo orifício, a profundidade de campo do sistema confocal é aproximadamente zero e a varredura ao longo do Z -eixo pode realizar tomografia óptica, formando um Observar a seção óptica bidimensional no ponto focalizado da amostra. Combinando a varredura do plano XY (plano focal) com a varredura do eixo Z (eixo óptico), a imagem tridimensional da amostra pode ser obtida acumulando imagens bidimensionais de camadas contínuas e processadas por um software de computador especial.
Ou seja, o pinhole de detecção e o pinhole da fonte de luz são sempre focados no mesmo ponto, de modo que a fluorescência excitada fora do plano focal não pode entrar no pinhole de detecção.
A expressão simples do princípio de funcionamento do laser confocal é que ele usa o laser como fonte de luz e, com base na imagem tradicional do microscópio de fluorescência, adiciona um dispositivo de varredura a laser e um dispositivo de foco conjugado e é um sistema para aquisição de imagem digital e processamento através do controle do computador.
