Conhecimento do microscópio confocal de fluorescência
O princípio básico da microscopia confocal de fluorescência: uma fonte de luz pontual é usada para irradiar a amostra, formando um pequeno ponto de luz bem definido no plano focal; a fluorescência emitida a partir deste ponto após a irradiação é coletada pela lente objetiva e enviada de volta ao longo do caminho da luz de irradiação original até o divisor de feixe que consiste em um espelho cromático bidirecional. O divisor de feixe envia a fluorescência diretamente para o detector. Tanto a fonte de luz quanto o detector têm, cada um, um orifício na frente deles, denominado orifício de iluminação e orifício de detecção, respectivamente. Ambos têm a mesma geometria, cerca de 100-200 nm, e são conjugados em relação ao ponto de luz no plano focal, ou seja, o ponto de luz passa através de uma série de lentes e pode, em última análise, ser focado tanto no iluminador quanto no plano focal. e furos de detector. Desta forma, a luz do plano focal pode convergir para dentro da abertura da sonda, enquanto a luz dispersa acima ou abaixo do plano focal é bloqueada fora da abertura da sonda e não pode ser visualizada. O laser varre a amostra ponto por ponto, e o tubo fotomultiplicador após detectar o pinhole também obtém a imagem confocal da luz correspondente ponto por ponto, que é convertida em um sinal digital e transmitida ao computador, e finalmente converge em um claro imagem confocal de todo o plano focal na tela.
Cada imagem do plano focal é na verdade uma seção transversal óptica da amostra, e essa seção transversal óptica sempre tem uma certa espessura, também conhecida como folha óptica. Como a intensidade da luz no ponto focal é muito maior do que no ponto não focal, e a luz do plano não focal é filtrada pelo orifício, a profundidade de campo do sistema confocal é aproximada a zero, e a varredura ao longo da direção do eixo Z permite que a tomografia óptica forme uma fatia óptica bidimensional da amostra a ser observada no ponto focal. Combinando a varredura do plano XY (plano focal) com a varredura do eixo Z (eixo óptico), uma imagem tridimensional da amostra pode ser obtida acumulando camadas sucessivas de imagens bidimensionais, que são processadas por software de computador especializado.
Isso significa que o orifício de detecção e o orifício da fonte de luz estão sempre focados no mesmo ponto, de modo que a fluorescência excitada fora do plano focal não pode entrar no orifício de detecção.
O princípio de funcionamento do laser confocal é expresso simplesmente que ele usa o laser como fonte de luz, com base na imagem tradicional do microscópio de fluorescência, dispositivo adicional de varredura a laser e dispositivo de foco conjugado, através do controle do computador para realizar o sistema de aquisição e processamento de imagens digitais.
